噬菌體展示技術(shù)的原理及應(yīng)用

1、噬菌體展示技術(shù)的原理及應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)的原理及應(yīng)用 (Key words: Phage display) 1、噬菌體展示技術(shù)的原理2、噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀 3、噬菌體展示技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè) 4、展望 一一、噬菌體展示技術(shù)的原理LeadHvLinkLvEPIII融合蛋白PIII基因型表達(dá)型 噬菌體展示技術(shù)是將各種多肽或蛋白質(zhì)以融合蛋白的形式表達(dá)并展示在噬菌體表面，同時將其遺傳密碼包含于噬菌體內(nèi)部，這使得蛋白質(zhì)的功能與其基因密碼有機(jī)的連結(jié)在一起。 選擇方法： 淘選（Panning)而不是 篩選（Screening)非展示系統(tǒng) 展示系統(tǒng)Solid phase selection with i

2、mmunotubes BBBBBBvvImmunotubecoated withantigencoated withsteptavidin and biotinylated antigenBbiotin antigenSolution phase selection with biotinylated antigen Bind to Streptavidincoated microtitre wellsWash to remove unbound phage particles.Elute bound phageAmplify eluted phageRepeat selectionAnaly

3、zea) ELISAb) Specificityc) Sequencingd) Affinitye) ActivityE.coli感染和擴(kuò)增 固相 淘選系統(tǒng) 完整細(xì)胞 組織，器官 常規(guī)法 淘選方法 正負(fù)法 競爭法 噬菌體展示技術(shù)最關(guān)鍵的優(yōu)勢有三： 第一，淘選的高效率使得在極低的存在 水平下，挑選到高親和力噬菌體成為可能； 第二，所挑選到的噬菌體可在微量存在的情況下，通過感染細(xì)菌得到富集； 第三：展示的多肽或蛋白質(zhì)與其包含在噬菌體內(nèi)部的基因密碼的連接，使得結(jié)合肽或蛋白質(zhì)的序列分析既快速又簡便。 噬菌體（M13, T7, T4, ) 病毒（反轉(zhuǎn)錄病毒，桿狀病毒） 表面展示系統(tǒng) 細(xì)菌（葡萄球菌，E.

4、 Coli) 酵母 體外共價連接（蛋白DNA, 蛋白RNA) 診斷 被動免疫 抗體 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析 藥物導(dǎo)航 蛋白質(zhì)純化 應(yīng)用范圍： 受 體 配體 信 息 傳遞 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 詰抗劑 蛋白質(zhì)DNA 抑制劑 蛋白質(zhì)其他 多肽 診斷 基因表達(dá)控制 中和活力 藥物及藥物導(dǎo)航 酶及底物噬菌體抗體庫的構(gòu)建Antibody IgG structureAntibody IgG structureCLVLVHCH1VLCLVHCH1CH2CH2CH3CH3Antibody IgG structureVHVLCLCH1CH2CH3Hinge(Fab)2FabFcMembraneExtensionAntibody

5、 IgG structureVHVLCLCH1CH2CH3Antibody IgG structureVHVLCLCH1CH2CH3FvFvVHVLscFvVHVLSingle Chain Fragment variable 單克隆抗體 噬菌體抗體 雜交瘤技術(shù) 展示技術(shù)宿主細(xì)胞: 雜交瘤 細(xì)菌篩選范圍 : 103 107109時間: 幾個月 幾周操作: 繁雜 相對簡單免疫: 必須 可避免人源抗體: +費(fèi)用: 高 低生產(chǎn)量: 有限 無限基因獲取: 再克隆 直接應(yīng)用前景: 有限 不可估 二、噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀二、噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀 1. 抗體抗體： 抗狂犬病毒的單鏈抗體，抗狂犬病毒的單

6、鏈抗體， 抗抗HIV-1囊膜糖蛋白的單鏈抗體，此囊膜糖蛋白的單鏈抗體，此抗體可專一性殺死被抗體可專一性殺死被HIV-1感染并感染并表達(dá)有表達(dá)有g(shù)p120的淋巴細(xì)胞的淋巴細(xì)胞, 中和響中和響尾蛇毒素的單鏈抗，尾蛇毒素的單鏈抗， 等等等等。2. 疫苗：疫苗： 展示在噬菌體表面的展示在噬菌體表面的HIV-1 的的gp120-V3 環(huán)環(huán) 可象天然抗原一樣引起可象天然抗原一樣引起顯著的免疫應(yīng)答顯著的免疫應(yīng)答, 等等。等等。3. 多肽類藥物：多肽類藥物： 如一些激動劑或拮抗劑從多肽庫中分如一些激動劑或拮抗劑從多肽庫中分離鑒定出來；已獲得一離鑒定出來；已獲得一13 肽，它能中和肽，它能中和蛇毒蛇毒 -bun

7、garotoxin；從；從CX7C 多肽庫中多肽庫中掏選到一個多肽能與掏選到一個多肽能與 Hantavirus 結(jié)合，結(jié)合，并使該病毒不能結(jié)合或感染細(xì)胞。人血管并使該病毒不能結(jié)合或感染細(xì)胞。人血管促生素（促生素（angiogenin）是一種能促進(jìn)腫瘤）是一種能促進(jìn)腫瘤血管生長的蛋白，用這個蛋白去淘選一個血管生長的蛋白，用這個蛋白去淘選一個噬菌體展示多肽庫，所獲得的一個環(huán)狀噬菌體展示多肽庫，所獲得的一個環(huán)狀8肽能與血管促生素結(jié)合，并能阻遏血管促肽能與血管促生素結(jié)合，并能阻遏血管促生素的活性；等等。生素的活性；等等。4. 腫瘤藥物導(dǎo)航載體：腫瘤藥物導(dǎo)航載體： 用腫瘤細(xì)胞特殊的受體蛋白從展示文庫用腫

8、瘤細(xì)胞特殊的受體蛋白從展示文庫中淘選到的多肽或單鏈抗體，可以作為中淘選到的多肽或單鏈抗體，可以作為抗癌藥物的定向輸送工具抗癌藥物的定向輸送工具 。一個成功的。一個成功的實(shí)例是：將噬菌體多肽展示庫注射入具實(shí)例是：將噬菌體多肽展示庫注射入具有腫瘤的小鼠體內(nèi)，然后殺死小鼠，取有腫瘤的小鼠體內(nèi)，然后殺死小鼠，取出腫瘤，再將結(jié)合其上的噬菌體洗脫下出腫瘤，再將結(jié)合其上的噬菌體洗脫下來。展示在其上的多肽具有與該腫瘤的來。展示在其上的多肽具有與該腫瘤的特異性親和力。將此多肽與細(xì)胞毒素特異性親和力。將此多肽與細(xì)胞毒素 doxorubicin 偶聯(lián)。結(jié)果顯示，此偶聯(lián)物偶聯(lián)。結(jié)果顯示，此偶聯(lián)物具有更強(qiáng)的抑制腫瘤的效

9、果具有更強(qiáng)的抑制腫瘤的效果.5. 酶酶： 例：堿性磷酸酶，蛋白水解酶類，等等 6. 底物與抑制劑底物與抑制劑： 主要是蛋白酶的底物和其抑制劑。 7. 信息傳遞研究信息傳遞研究: 利用噬菌體展示多肽庫，發(fā)現(xiàn)了一些受體，如凝血致活酶、黑皮質(zhì)素受體、CD80 和一個 Hantaviral 受體；受體的配體， 如血管促生素、 -bungarotoxin， 和一些大蛋白分子中的折疊區(qū)域，如SH2、SH3 和 WW 區(qū)域。從多肽庫中可分離到與天然激素相似的、與受體結(jié)合的高親和力的多肽, 因此用完整細(xì)胞可以從多肽庫中找到受體的高選擇性配體。在不知道任何有關(guān)的受體和配體信息的情況下，用完整細(xì)胞和組織或動物，可

10、篩選到特異與靶組織結(jié)合的多肽和蛋白。 8. DNA8. DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白： 鋅指蛋白是一類 DNA 結(jié)合小肽結(jié)構(gòu)物，這些結(jié)構(gòu)含有鋅，能用于構(gòu)建一個大的蛋白區(qū)域，去識別和結(jié)合特殊的 DNA 序列。噬菌體展示技術(shù)也可以用于創(chuàng)造一個大的、具有識別不同 DNA 序列的 鋅指的多肽庫。利用這個多肽庫，可以研究有關(guān)氨基酸序列與 DNA 結(jié)合位點(diǎn)之間的識別規(guī)則，可以通過設(shè)計(jì) 鋅指多肽去控制基因的表達(dá)，比如抑制小鼠細(xì)胞系中的癌基因，也可以啟動表達(dá)質(zhì)粒的基因，或干擾病毒感染生活周期。1 9. 9. 蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)： 噬菌體展示技術(shù)作為一個多肽和蛋白質(zhì)合成的工具箱，使得任何蛋白均能找到與其有特異結(jié)合力

11、的多肽和蛋白質(zhì)，其構(gòu)建的文庫的滴度可達(dá)1012。蛋白質(zhì)組學(xué)的基本點(diǎn)就是利用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用，對成千上萬種蛋白質(zhì)同時進(jìn)行分析。而噬菌體展示技術(shù)正好能符合這種要求。例：將噬菌體展示cDNA 文庫制成蛋白點(diǎn)陣，成功的應(yīng)用于尋找與過敏癥有關(guān)的蛋白質(zhì)。 疾病的發(fā)生給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。而疾病防治技術(shù)的開發(fā)仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足漁業(yè)發(fā)展的要求。 我國水產(chǎn)病害的防治目前主要以抗生素及各種消毒化學(xué)品為主。 尋找新的病害防治途徑。三、 噬菌體展示技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè) 5. 展望九十年代末，生物技術(shù)、基因和蛋白質(zhì)、生物信息和分子文庫系統(tǒng)的發(fā)展，大大促進(jìn)了新藥發(fā)現(xiàn)的技術(shù)革命，其中噬菌體展示技術(shù)表現(xiàn)出

12、獨(dú)特的優(yōu)越性，由此而發(fā)展出的一些新方法更是大大的擴(kuò)展了新藥的發(fā)現(xiàn)和利用范圍。 隨著噬菌體展示技術(shù)在尋找新藥道路上的不斷成功，這種方法不僅限于人類醫(yī)藥的發(fā)現(xiàn)，也可以用于植物病蟲害的防治，畜牧業(yè)病害的防治以及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)病害的防治，特別是在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，可避免濫用抗生素和化學(xué)藥品，防止水體進(jìn)一步地污染。 很明顯，噬菌體展示技術(shù)作為一個多肽和蛋白合成的工具箱，使得任何蛋白均能找到與其有特異結(jié)合力的多肽和蛋白，這將極大地促進(jìn)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與其它分子的結(jié)合和相互作用是生命現(xiàn)象的主要過程。隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng)新，所獲得的信息越來越多，如果能與生物芯片技術(shù)以及生物信息技術(shù)結(jié)合起來，其應(yīng)用范圍和能力將會得到更大的發(fā)展。 結(jié)合水生所