生物工程下游技術(shù)第三章微載體培養(yǎng)技術(shù)ppt課件

1、第三章第三章 微載體培育技術(shù)微載體培育技術(shù)microcarrier culture techniquemicrocarrier culture technique 一、何謂微載體？一、何謂微載體？指直徑指直徑60-250m60-250m，能適用于貼壁細(xì)胞生長的微珠。，能適用于貼壁細(xì)胞生長的微珠。普通是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。普通是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。最初采用在培育液中加人一定數(shù)量的小滾瓶，最初采用在培育液中加人一定數(shù)量的小滾瓶，添加細(xì)胞生長的貼壁面積。添加細(xì)胞生長的貼壁面積。此方法構(gòu)造簡單，本錢低，反復(fù)性好，放此方法構(gòu)造簡單，本錢低，反復(fù)性好，放大過程可依托滾瓶

2、數(shù)量的添加。大過程可依托滾瓶數(shù)量的添加。但產(chǎn)率低，勞動(dòng)強(qiáng)度大，占空間大。但產(chǎn)率低，勞動(dòng)強(qiáng)度大，占空間大。如何添加細(xì)胞生長的貼壁面積？如何添加細(xì)胞生長的貼壁面積？微載體系統(tǒng)微載體系統(tǒng)19671967年被用于動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培育。年被用于動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培育。兼具懸浮培育和貼壁培育的優(yōu)點(diǎn)，放大容易。兼具懸浮培育和貼壁培育的優(yōu)點(diǎn)，放大容易?，F(xiàn)廣泛用于培育各類細(xì)胞，消費(fèi)疫苗、蛋白質(zhì)產(chǎn)品。現(xiàn)廣泛用于培育各類細(xì)胞，消費(fèi)疫苗、蛋白質(zhì)產(chǎn)品。微載體培微載體培育系統(tǒng)育系統(tǒng)培育培育4h4h，微載體間的細(xì)，微載體間的細(xì)胞胞“橋聯(lián)橋聯(lián) 200 200 電鏡下串在一同的電鏡下串在一同的肝細(xì)胞微載體肝細(xì)胞微載體730 730

3、由于肝細(xì)胞的粘附作用微載由于肝細(xì)胞的粘附作用微載體構(gòu)成體構(gòu)成“串珠串珠 400 400 脊髓灰質(zhì)炎、狂脊髓灰質(zhì)炎、狂犬和乙腦等疫苗犬和乙腦等疫苗二、微載體的商品類型二、微載體的商品類型第一種微載體：第一種微載體： Van Wezel Van Wezel用用DEAE-Sephadex A50DEAE-Sephadex A50研研制而來制而來市售國際種類有十幾種以上：市售國際種類有十幾種以上：液體微載體、大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、液體微載體、大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMAPHEMA微載體、甲殼質(zhì)微載體、聚氨酯泡沫微微載體、甲殼質(zhì)微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微

4、載體等載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等常用商品化微載體有三種：常用商品化微載體有三種： Cytodex1 Cytodex1、2 2、3 3，CytoporeCytopore和和CytolineCytoline顯微鏡下的高密度微載體顯微鏡下的高密度微載體l優(yōu)良的微載體應(yīng)具有的特性優(yōu)良的微載體應(yīng)具有的特性價(jià)廉，能反復(fù)運(yùn)用。價(jià)廉，能反復(fù)運(yùn)用。不含能毒害細(xì)胞的成分；不含能毒害細(xì)胞的成分；微載體須與細(xì)胞有良好的相容性；微載體須與細(xì)胞有良好的相容性；密度應(yīng)略大于培育基；密度應(yīng)略大于培育基；粒徑在粒徑在4040120m120m范圍，生理鹽水溶脹后增大到范圍，生理鹽水溶脹后增大到60250 60250

5、mm，粒度分布地均勻，徑差不大于，粒度分布地均勻，徑差不大于2025m2025m；良好的光學(xué)透明性；良好的光學(xué)透明性；能在能在PBSPBS中耐中耐120125120125、2030min2030min高溫滅菌；高溫滅菌；應(yīng)是非剛性資料；應(yīng)是非剛性資料；不吸收培育基中的營養(yǎng)成分；不吸收培育基中的營養(yǎng)成分；收獲細(xì)胞或細(xì)胞制品容易，不影響蛋白質(zhì)分別純化；收獲細(xì)胞或細(xì)胞制品容易，不影響蛋白質(zhì)分別純化；三、微載體培育原理與操作三、微載體培育原理與操作 1 1、原理：、原理：將對細(xì)胞無害的顆粒將對細(xì)胞無害的顆粒微微載體參與到培育容器的培育液中，載體參與到培育容器的培育液中，作為載體，使細(xì)胞在微載體外表作為

6、載體，使細(xì)胞在微載體外表附著生長，同時(shí)經(jīng)過繼續(xù)攪動(dòng)使附著生長，同時(shí)經(jīng)過繼續(xù)攪動(dòng)使微載體一直堅(jiān)持懸浮形狀。微載體一直堅(jiān)持懸浮形狀。 絲網(wǎng)絲網(wǎng)微載體微載體通氣的培育基通氣的培育基鼓泡器鼓泡器攪拌葉輪攪拌葉輪微載體培育安裝圖微載體培育安裝圖微載體的大?。涸龃髥挝惑w積內(nèi)外表積S/F對細(xì)胞的生長非常有利。使微載體直徑盡能夠小，最好控制在100-200m之間。 微載體的密度：普通為微載體的密度：普通為1.03-1.05g/cm21.03-1.05g/cm2，隨著細(xì)胞的貼附及生長，隨著細(xì)胞的貼附及生長，密度可逐漸增大。密度可逐漸增大。 微載體的外表電荷：據(jù)研討，控制細(xì)胞貼壁的根本要素是電荷密度微載體的外表電

7、荷：據(jù)研討，控制細(xì)胞貼壁的根本要素是電荷密度而不是電荷性質(zhì)。假設(shè)電荷密度太低，細(xì)胞貼附不充分，但電荷密度而不是電荷性質(zhì)。假設(shè)電荷密度太低，細(xì)胞貼附不充分，但電荷密度過大，反而會(huì)產(chǎn)生過大，反而會(huì)產(chǎn)生“毒性效應(yīng)。毒性效應(yīng)。 細(xì)胞能否黏附，主要取決于細(xì)胞與微載體的接細(xì)胞能否黏附，主要取決于細(xì)胞與微載體的接觸概率和相融性。觸概率和相融性。 細(xì)胞增殖階段：黏附貼壁、生長和擴(kuò)展成單層細(xì)胞增殖階段：黏附貼壁、生長和擴(kuò)展成單層貼壁依賴性細(xì)胞在微載體外表上：貼壁依賴性細(xì)胞在微載體外表上：貼附是進(jìn)一步鋪展和生長的關(guān)鍵，主要是靠靜貼附是進(jìn)一步鋪展和生長的關(guān)鍵，主要是靠靜電引力和范德華力電引力和范德華力VeroVer

8、o細(xì)胞在細(xì)胞在Cytodex-3Cytodex-3微載體外表粘附鋪展的形貌變化微載體外表粘附鋪展的形貌變化通常做法：貼壁期采用低攪拌轉(zhuǎn)速，時(shí)攪時(shí)停；數(shù)通常做法：貼壁期采用低攪拌轉(zhuǎn)速，時(shí)攪時(shí)停；數(shù)小時(shí)后，待細(xì)胞附著于微載體外表時(shí)，維持設(shè)定的小時(shí)后，待細(xì)胞附著于微載體外表時(shí)，維持設(shè)定的低轉(zhuǎn)速，進(jìn)入培育階段。微載體培育的攪拌非常慢，低轉(zhuǎn)速，進(jìn)入培育階段。微載體培育的攪拌非常慢，最大速度最大速度75r/min75r/min。 2 2、攪拌轉(zhuǎn)速：、攪拌轉(zhuǎn)速：動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁，對剪切力敏感，無法動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁，對剪切力敏感，無法靠提高攪拌轉(zhuǎn)速來添加接觸概率?？刻岣邤嚢柁D(zhuǎn)速來添加接觸概率。攪拌速率越大，制

9、得的微球越小，攪拌速率越大，制得的微球越小，聚合物濃度越大，制得的微球較大聚合物濃度越大，制得的微球較大以聚己內(nèi)酯以聚己內(nèi)酯PCLPCL、聚左旋乳酸、聚左旋乳酸PLLAPLLA、聚乙醇酸、聚乙醇酸聚乳酸共聚物聚乳酸共聚物PGLAPGLA為基質(zhì)制備可生物降解微載體為基質(zhì)制備可生物降解微載體 3 3、細(xì)胞與微載體的相融性：、細(xì)胞與微載體的相融性： 與微載體外表理化性質(zhì)有關(guān)。普通細(xì)胞在進(jìn)入生理與微載體外表理化性質(zhì)有關(guān)。普通細(xì)胞在進(jìn)入生理pHpH值時(shí)，外表帶負(fù)電荷。假設(shè)微載體帶正電荷，那么值時(shí)，外表帶負(fù)電荷。假設(shè)微載體帶正電荷，那么利用靜電引力可加快細(xì)胞貼壁速度。假設(shè)微載體帶負(fù)利用靜電引力可加快細(xì)胞貼

10、壁速度。假設(shè)微載體帶負(fù)電荷，因靜電斥力使細(xì)胞難于黏附貼壁，但培育液中電荷，因靜電斥力使細(xì)胞難于黏附貼壁，但培育液中溶有或微載體外表吸附著二價(jià)陽離子作為媒介時(shí)，那溶有或微載體外表吸附著二價(jià)陽離子作為媒介時(shí)，那么帶負(fù)電荷的細(xì)胞也能貼附。么帶負(fù)電荷的細(xì)胞也能貼附。 (a)MCC(a)MCC細(xì)胞，未經(jīng)處置的細(xì)胞，未經(jīng)處置的Cytodex-3Cytodex-3外表；外表；(b)MCC(b)MCC細(xì)胞，用纖粘連蛋細(xì)胞，用纖粘連蛋白處置后的白處置后的Cytodex-3Cytodex-3外表外表 (c)Vero (c)Vero細(xì)胞，未經(jīng)處置的細(xì)胞，未經(jīng)處置的Cytodex-3Cytodex-3外表；外表； (

11、d) Vero(d) Vero細(xì)胞，用層粘連蛋白處置的細(xì)胞，用層粘連蛋白處置的Cytodex-3Cytodex-3外表外表(e) Vero(e) Vero細(xì)胞，細(xì)胞，用纖粘連蛋白處置的用纖粘連蛋白處置的Cytodex-3Cytodex-3外表外表細(xì)胞細(xì)胞VeroVero和和MCCMCC在不同外源基質(zhì)處置的在不同外源基質(zhì)處置的Cytodex-3Cytodex-3微載體上貼附微載體上貼附 4 4、細(xì)胞在微載體外表的生長、細(xì)胞在微載體外表的生長 受影響要素：受影響要素：細(xì)胞方面：細(xì)胞群體、形狀和類型。細(xì)胞方面：細(xì)胞群體、形狀和類型。 微載體方面：微載體外表形狀、吸附的大分子和微載體方面：微載體外表形

12、狀、吸附的大分子和離子；微載體外表光滑時(shí)細(xì)胞擴(kuò)展快，外表多孔離子；微載體外表光滑時(shí)細(xì)胞擴(kuò)展快，外表多孔那么擴(kuò)展慢。那么擴(kuò)展慢。 培育環(huán)境中：培育基組成、溫度、培育環(huán)境中：培育基組成、溫度、pHpH、DODO以及代以及代謝廢物等均明顯影響細(xì)胞在微載體上的生長。假謝廢物等均明顯影響細(xì)胞在微載體上的生長。假設(shè)所處條件最優(yōu)，那么細(xì)胞生長快；反之生長速設(shè)所處條件最優(yōu)，那么細(xì)胞生長快；反之生長速度慢。度慢。 微載體系統(tǒng)培育細(xì)胞的步驟：微載體系統(tǒng)培育細(xì)胞的步驟：(1)(1)選擇適宜的微載體類型選擇適宜的微載體類型(2)(2)浸泡水化及消毒浸泡水化及消毒(3)(3)接種接種 (4)(4)培育察看與細(xì)胞記數(shù)培育

13、察看與細(xì)胞記數(shù) (5)(5)消化消化(6)(6)分別細(xì)胞分別細(xì)胞(7)(7)傳代培育傳代培育交聯(lián)葡聚糖交聯(lián)葡聚糖纖維素為基質(zhì)微載體纖維素為基質(zhì)微載體蛋白質(zhì)為基質(zhì)微載體變性膠原微載體蛋白質(zhì)為基質(zhì)微載體變性膠原微載體: :蛋蛋黃色，外表特性好，易與細(xì)胞結(jié)合黃色，外表特性好，易與細(xì)胞結(jié)合高分子資料為基質(zhì)微載體高分子資料為基質(zhì)微載體無機(jī)玻璃基質(zhì)微載體無機(jī)玻璃基質(zhì)微載體 微載體基質(zhì)微載體基質(zhì)PCLPCL微球外表多皺，微球外表多皺，PLLAPLLA微球外表布滿坑洞，微球外表布滿坑洞，PGLAPGLA微球外表光滑微球外表光滑不同種類聚酯的微球外表形貌差別不同種類聚酯的微球外表形貌差別多孔載體培育多孔載體培育

14、優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): :降低血清用量，添加細(xì)胞固定性。生長空間大，免降低血清用量，添加細(xì)胞固定性。生長空間大，免受機(jī)械損傷，可以提高攪拌強(qiáng)度和通氣量，強(qiáng)化傳受機(jī)械損傷，可以提高攪拌強(qiáng)度和通氣量，強(qiáng)化傳質(zhì)。質(zhì)。多孔載體不僅能培育貼壁細(xì)胞，也適宜懸浮細(xì)胞的多孔載體不僅能培育貼壁細(xì)胞，也適宜懸浮細(xì)胞的固定化延續(xù)灌流培育。固定化延續(xù)灌流培育。多孔載體固定細(xì)胞過程簡單，對細(xì)胞無毒害和損傷，多孔載體固定細(xì)胞過程簡單，對細(xì)胞無毒害和損傷，細(xì)胞可從長滿細(xì)胞的微載體中自動(dòng)轉(zhuǎn)移到未長細(xì)胞細(xì)胞可從長滿細(xì)胞的微載體中自動(dòng)轉(zhuǎn)移到未長細(xì)胞的新載體上生長，接種方便，培育簡單，特別適宜的新載體上生長，接種方便，培育簡單，特別適宜于反響

15、器大規(guī)模培育。于反響器大規(guī)模培育。多孔載體制備的資料選擇多孔載體制備的資料選擇(1)(1)生物相容性：資料對細(xì)胞必需無毒害，對貼壁生物相容性：資料對細(xì)胞必需無毒害，對貼壁細(xì)胞有良好的黏附作用。細(xì)胞有良好的黏附作用。(2)(2)機(jī)械穩(wěn)定性：微載體在長時(shí)間攪拌形狀下不破機(jī)械穩(wěn)定性：微載體在長時(shí)間攪拌形狀下不破碎；同時(shí)滿足微載體清洗處置、碎；同時(shí)滿足微載體清洗處置、回收利用的要求。回收利用的要求。(3)(3)熱穩(wěn)定性：在熱穩(wěn)定性：在121 121 、蒸汽滅菌下不分解、蒸汽滅菌下不分解、不破碎、不軟化。不破碎、不軟化。主要思索生物相容性、機(jī)械穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性主要思索生物相容性、機(jī)械穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性5

16、5、微載體培育操作要點(diǎn)、微載體培育操作要點(diǎn) 培育初期：培育初期： 保證培育基與微球體處于穩(wěn)定的保證培育基與微球體處于穩(wěn)定的pHpH與溫度程度，接與溫度程度，接種細(xì)胞對數(shù)生長期至終體積種細(xì)胞對數(shù)生長期至終體積1/31/3的培育液中，的培育液中，以添加細(xì)胞與微載體接觸的時(shí)機(jī)。不同的微載體所以添加細(xì)胞與微載體接觸的時(shí)機(jī)。不同的微載體所用濃度及接種細(xì)胞密度不同，常運(yùn)用用濃度及接種細(xì)胞密度不同，常運(yùn)用2-3g/L2-3g/L的微載的微載體含量，更高的微載體濃度需求控制環(huán)境或經(jīng)常換體含量，更高的微載體濃度需求控制環(huán)境或經(jīng)常換液。液。 l貼壁階段貼壁階段3-8d3-8d后，緩慢參與培育液至任務(wù)體積，后，緩慢

17、參與培育液至任務(wù)體積，并且添加攪拌速度保證完全均質(zhì)混合。并且添加攪拌速度保證完全均質(zhì)混合。 培育維持期：進(jìn)展細(xì)胞計(jì)數(shù)胞核計(jì)數(shù)、葡萄培育維持期：進(jìn)展細(xì)胞計(jì)數(shù)胞核計(jì)數(shù)、葡萄糖測定及細(xì)胞形狀鏡檢。隨著細(xì)胞增殖，微球變糖測定及細(xì)胞形狀鏡檢。隨著細(xì)胞增殖，微球變得越來越重，需添加攪拌速率。經(jīng)過得越來越重，需添加攪拌速率。經(jīng)過3d3d左右，培左右，培育液開場呈酸性，需換液停頓攪拌，讓微珠沉育液開場呈酸性，需換液停頓攪拌，讓微珠沉淀淀5min5min，棄掉適宜體積的培育液，緩慢參與新穎，棄掉適宜體積的培育液，緩慢參與新穎培育液培育液3737，重新開場攪拌。，重新開場攪拌。 收獲細(xì)胞：首先排干培育液，至少用緩

18、沖液漂洗1遍，然后參與相應(yīng)的酶，快速攪拌75-125r/min20-30min。然后解離搜集細(xì)胞及其產(chǎn)品。 微載體培育的放大：可以經(jīng)過添加微載體的含量或培育體積進(jìn)展放大。運(yùn)用異倍體或原代細(xì)胞培育消費(fèi)疫苗、干擾素，已被放大至4000L以上。 細(xì)胞形狀豐滿、細(xì)胞形狀豐滿、生長良好生長良好細(xì)胞形狀更加立體，輪廓明晰，細(xì)胞數(shù)量細(xì)胞形狀更加立體，輪廓明晰，細(xì)胞數(shù)量明顯添加，少量微載體上細(xì)胞幾乎長滿明顯添加，少量微載體上細(xì)胞幾乎長滿微載體上細(xì)胞根本長微載體上細(xì)胞根本長滿，細(xì)胞形狀安康滿，細(xì)胞形狀安康微載體上細(xì)胞更加致密，細(xì)胞微載體上細(xì)胞更加致密，細(xì)胞密度到達(dá)密度到達(dá)5106個(gè)個(gè)/ml以上以上微載體上細(xì)胞依

19、然良好，微載體上細(xì)胞依然良好，沒有明顯細(xì)胞零落景象沒有明顯細(xì)胞零落景象 Marc145細(xì)胞微載體培育第細(xì)胞微載體培育第1天天 Marc145細(xì)胞微載體培育第細(xì)胞微載體培育第2天天 Marc145細(xì)胞微載體培育第細(xì)胞微載體培育第3天天 Marc145細(xì)胞微載體培育第細(xì)胞微載體培育第4天天 Marc145細(xì)胞微載體培育第細(xì)胞微載體培育第10天天四、微載體培育優(yōu)點(diǎn)四、微載體培育優(yōu)點(diǎn) 培育系統(tǒng)占地面積和空間小。培育系統(tǒng)占地面積和空間小。 外表積外表積/ /體積大，因此單位體積培育液的細(xì)胞產(chǎn)率高；體積大，因此單位體積培育液的細(xì)胞產(chǎn)率高； 把懸浮培育和貼壁培育交融在一同，兼有兩者的優(yōu)點(diǎn)；把懸浮培育和貼壁培育交融在一同，兼有兩者的優(yōu)點(diǎn)； 可用簡單的顯微鏡察看細(xì)胞在微珠外表的生長情況；可用簡單的顯微鏡察看細(xì)胞在微珠外表的生長情況；簡化了細(xì)胞生長各種環(huán)境要素的檢測和控制，重現(xiàn)性好；簡化了細(xì)胞生長各種環(huán)境要素的檢測和控制，重現(xiàn)性好； 培育基利用率較高；培育基利用率較高； 放大容易；放大容易； 細(xì)胞收獲過程不復(fù)雜；細(xì)胞收獲過程不復(fù)雜