DNA重組技術(shù)的基本工具

1、“工欲善其事，必先利其器”。我國擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，就是通過精心設(shè)計(jì)，用“分子工具”構(gòu)建成的。培育抗蟲棉首先要在體外對含有抗蟲基因的DNA分子進(jìn)行“切割”、改造、修飾和“拼接”，然后，導(dǎo)入棉花體細(xì)胞內(nèi)，并使重組DNA在細(xì)胞中表達(dá)。實(shí)現(xiàn)這一精確的操作過程至少需要三種工具，即準(zhǔn)確切割DNA的“手術(shù)刀”、將DNA片段再連接起來的“縫合針”將體外重組好的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的“運(yùn)輸工具”。科學(xué)家已經(jīng)找到并運(yùn)用了這三種必需的工具，才使培育抗蟲棉這一奇妙構(gòu)想變成了現(xiàn)實(shí)（圖1-1）。圖1-1 抗蟲棉（左側(cè)為對照）尋根問底根據(jù)你所掌握的知識(shí)，你能推測這類酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？限制性核酸內(nèi)

2、切酶“分子手術(shù)刀”切割DNA的工具是限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonucleases)，又稱限制酶（restrictionenzyme）。這類酶主要是從原核生物中分離純化出來的。迄今已從近300種不同的微生物中分離出了約4000種限制酶。它們能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵（圖1-2）斷開。大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸組成，例如，EcoRI、SmaI限制酶識(shí)別的序列均為6個(gè)核苷酸，也有少數(shù)限制酶的識(shí)別序列由4、5或8個(gè)核苷酸組成。DNA分子經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式黏性末端和平末端（圖1

3、-3）。當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的中心軸線（圖中虛線）兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開時(shí)，產(chǎn)生的是黏性末端，而當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的中心軸線處切開時(shí)，產(chǎn)生的則是平末端。生物技術(shù)資料卡限制酶的名字怎么起？限制酶的名字是怎么起的呢？是用生物屬名的頭一個(gè)字母與種名的頭兩個(gè)字母，組成了3個(gè)字母的略語，以此來表示這個(gè)酶是從哪個(gè)生物中分離出來的。例如，一種限制酶是從大腸桿菌（Escherichia coli）的R型菌株分離來的，就用字母EcoR表示；如果它是從大腸桿菌EcoRI 。DNA連接酶“分子縫合針”將切下來的DNA片段拼接成新的DNA分子，是靠DNA連接酶來完成的。1967年，世界上幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)

4、了一種能夠?qū)蓷lDNA鏈連接起來的酶，稱之為DNA連接酶（DNAligase）。根據(jù)酶的來源不同，可以將這些酶分為兩類：一類是從大腸桿菌中分離得到的，稱為E·coliDNA連接酶；另一類是從T4噬菌體中分離出來的，稱為T4DNA連接酶。這兩類酶都是將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵（圖1-4），但這兩種酶的作用有所差別：E·coli DNA連接酶只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端之間連接起來，不能將雙鏈DNA片段平末端之間進(jìn)行連接。而T4DNA連接酶既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端，但連

5、接平末端之間的效率比較低。尋根問底DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？想一想，具備什么條件才能充當(dāng)“分子運(yùn)輸車”？基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體“分子運(yùn)輸車”用什么方法才能將外源基因送入細(xì)胞中呢？通常是利用質(zhì)粒（plasmid）作為載體（vector），將基因送入細(xì)胞中。質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。質(zhì)粒DNA分子上有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，供外源DNA片段（基因）插入其中。攜帶外源DNA片段的質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞后，在細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到染色體DNA上，隨染色體DNA進(jìn)行同步復(fù)制。質(zhì)粒DNA分子上有特殊的標(biāo)記基因，

6、如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇（圖1-5）。在基因工程中使用的載體除質(zhì)粒外，還有噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒等。它們來源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制以及插入片段大小上也有很大差別。這些基因工程載體的作用，就相當(dāng)于一種運(yùn)輸工具，因此將它們比喻為“分子運(yùn)輸車”。在進(jìn)行基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。模擬制作目的要求模擬重組DNA分子的操作過程，說出其基本原理。材料用具兩種顏色（如綠色和粉紅色）的硬紙板，剪刀（代表EcoR),透明膠條（代表DNA連接酶)。方法步驟1. 選兩種顏色的等寬硬紙板，如綠色紙板和粉紅色紙板。在

7、綠硬紙板上依次等距離寫上下列字母（字母要清晰、工整)：在粉紅色硬紙板上依次等距離寫上下列字母:2.用剪刀（代表EcoRI）進(jìn)行DNA“切割”。先分別從兩塊硬紙板上的一條DNA上找出G-A-A-T-T-C序列，并選G-A之間作切口進(jìn)行“切割”然后再從另一條鏈上互補(bǔ)的堿基之間尋找EcoRI相應(yīng)的切口剪開。3.待綠、粉紅兩色硬紙板上的切割位點(diǎn)全部切開后，將粉紅色紙板上的DNA片段，重組到綠色硬紙板的切口處。此時(shí)用不干膠（代表DNA連接酶）將切口黏結(jié)起來。這樣你就完成了一個(gè)重組DNA分子的模擬制作。如果你的操作是正確的，不同顏色的黏性末端能互補(bǔ)配對。如果你制作的黏性末端不能互補(bǔ)配對，說明你的操作有誤，應(yīng)重新做一次。思考與討論請按真實(shí)操作過程思考一下：1.你模擬插入的DNA片段能稱得上一個(gè)基因嗎？2.如果你操作失誤，堿基不能配對，可能是什么原因造成的？進(jìn)一步模擬操作如果你有興趣，可自制有切割位點(diǎn)的紙板，然后按上述步驟剪切和連接，制成一個(gè)新的重組DNA分子。思考與探究1.限制酶在DNA的任何部位都能將DNA切開嗎？以下是四種不同限制酶切割形成的DNA片段：你能用DNA連接酶將它們連接起來嗎？_和_能連接