Ni柱純化His-tag蛋白質(zhì)

1、Ni 柱純化 His-tag 蛋白質(zhì) 一 非變性條件下抽提 His-Tag 蛋白質(zhì) 下列方法適用于從細(xì)菌中抽提通常含有連續(xù) 6 個組氨酸尾（ His Tag Protein ） 的具有天 然結(jié)構(gòu)的可溶性重組蛋白質(zhì)（ Native Protein ）。其他來源的蛋白質(zhì)樣品，如果目標(biāo)蛋白質(zhì)具 有 His-Tag 結(jié)構(gòu)，提供的層析方法可供參考。1.樣品準(zhǔn)備1）準(zhǔn)備細(xì)胞，接種，誘導(dǎo)表達(dá)。對于實驗室用的 pET載體表達(dá)系列，在細(xì)胞OD600=0.5-0.8 時，用 1mM IPTG 誘導(dǎo) 1-3 小時，可以獲得理想的表達(dá)效率。收集細(xì)胞，置于 -70度或立即 進(jìn)行步驟 2 操作。2）加入1/20細(xì)胞生長體

2、積的 NTA-0 Buffer（20mM Tris-HCl pH7.9 ，0.5M NaCl ， 10% Glycerol ） 和 PMSF。 PMSF 用無水乙醇配制成 200mM 儲存液， -20 度或 4度保存； PMSF 使用的工作 濃度位 1 mM ；注意： PMSF 見水分解，需要在使用前加入。該步驟冰上操作。3）將細(xì)胞懸浮起來， 加入溶菌酶 （工作濃度位 0.2-0.4mg/ml ，如果表達(dá)的宿主細(xì)胞內(nèi)含 pLysS 或pLysE，可以不加溶菌酶），混勻，冰上放置 30分鐘，超聲或勻漿破碎細(xì)胞。該步驟冰上 操作。4）加入 10% Triton X-100, 使 Triton 的終

3、濃度為 0.05%，充分混勻，冰上放置 15 分鐘，間或 混勻）；冰上超聲破碎細(xì)胞，同時降低粘稠度。5）加入1M MgCI2，使 MgCI2的終濃度為1mM，混勻。加入 DNase,使DNase的終濃度為 10mg/ml ，混勻，室溫放置 10分鐘。6）5000轉(zhuǎn)/分 （20,000xg以上），4度離心15分鐘以上。取上清，置于冰上備用或-20度保存。 2層析1）將NTA樹脂裝入合適的層析柱，層析用 10倍NTA體積的NTA-0 Buffer洗。2）將樣品（步驟2（ 6）加到NTA層析柱中，流速控制在 15ml/小時左右，收集穿透部分， 用于 SDS/PAGE 分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。3）層析用

4、5倍NTA體積的NTA-0 Buffer洗，流速控制在 30ml/小時左右。4）分別用 5 倍 NTA 體積的 NTA-20 , NTA-40 , NTA-60 , NTA-80，NTA-100，NTA-200，NTA-1000Buffer洗脫，流速控制在15ml/小時左右，收集洗脫液，每管收集一個NTA體積。5）確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。最為有效的方式是SDS/PAGE 分析。也可以用BBST 的 Bradford 蛋白質(zhì)測定試劑盒，快速確定蛋白質(zhì)的含量，然后用SDS/PAGE 分析蛋白質(zhì)的分布。6）目標(biāo)蛋白質(zhì)需要進(jìn)一步純化需要根據(jù)蛋白質(zhì)的用途確定。純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)的保存條件需要根

5、據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)和用途確定。附溶液配方：NTA-0 Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol,NTA-20 Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 20mM Imidazole（ 咪唑）NTA-40 Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 40mM Imidazole（ 咪唑） NTA-60Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 60mM

6、Imidazole（ 咪唑）NTA-80Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 80mM Imidazole（ 咪唑 ）NTA-100Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 100mM Imidazole（咪唑 ）NTA-200Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 200mM Imidazole（咪唑 ）NTA-1000 Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl,

7、 10% Glycerol, 1000mM Imidazole （ 咪唑 ）二變性條件下從包涵體中純化 His-Tag 的蛋白質(zhì) 有些蛋白質(zhì)細(xì)菌或其他細(xì)胞中表達(dá)效率很高， 但溶解性很差， 通常形成包涵體。 這些蛋白質(zhì) 的溶解通常需要用鹽酸胍或尿素。與 MBP 和 GST 的親和層析材料相比， NTA 樹脂可以在 6M 的鹽酸胍存在的情況下與具有 His Tag 的蛋白質(zhì)結(jié)合。整個層析過程都是在有鹽酸胍的 條件下進(jìn)行。純化后的蛋白質(zhì)需要進(jìn)行復(fù)性，正確復(fù)性的蛋白質(zhì)才具有生物學(xué)活性。 下列方法（步驟 4-5）用于從細(xì)菌中抽提含 His-Tag 位于包涵體變性蛋白質(zhì)。1樣品準(zhǔn)備1）準(zhǔn)備細(xì)胞，接種，誘導(dǎo)

8、表達(dá)。對于實驗室用的pET 載體表達(dá)系列，在細(xì)胞 OD600=0.5-0.8時，用 1mM IPTG 誘導(dǎo) 1-3 小時，可以獲得理想的表達(dá)效率。收集細(xì)胞，置于 -70度或立即 進(jìn)行步驟 2 操作。2）加入 1/20 細(xì)胞生長體積的 GuNTA-0 Buffer （20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl， 10%Glycerol, 6M Guanidium HCI ）和 PMSF。PMSF 用無水乙醇配制成 200mM 儲存液，-20 度 或4度保存；PMSF使用的工作濃度位 1mM ;注意：PMSF見水分解，需要在使用前加入。3）將細(xì)胞懸浮起來，冰上超聲破碎細(xì)胞，降低粘稠

9、度。4）室溫放置 30 分鐘，間或混勻或用磁力攪拌。5）15000轉(zhuǎn)/分（ 20,000xg以上），4度離心15分鐘以上。取上清，置于冰上備用或-20度保存。2 層析1）將NTA樹脂裝入合適的層析柱，層析用 10倍NTA體積的GuNTA-0 Buffer洗。2）將樣品（步驟2（ 5）加到NTA層析柱中，流速控制在15ml/小時左右，收集穿透部分，用于 SDS/PAGE 分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。3）層析用5倍NTA體積的GuNTA-0 Buffer洗，流速控制在 30ml/小時左右。4）分別用 5倍 NTA 體積 GuNTA-20 ， GuNTA-40 ， GuNTA-60 ， GuNTA-100

10、， GuNTA-500 洗脫，流速控制在15ml/小時左右，收集洗脫液，每管收集一個NTA體積。5）確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。最為有效的方式是SDS/PAGE 分析。也可以用BBST 的 Bradford 蛋白質(zhì)測定試劑盒，快速確定蛋白質(zhì)的含量，然后用SDS/PAGE 分析蛋白質(zhì)的分布。6）目標(biāo)蛋白質(zhì)需要進(jìn)一步純化需要根據(jù)蛋白質(zhì)的用途確定。7）純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)需要復(fù)性，復(fù)性常用的手段可以參考有關(guān)手冊確定的原則， 根據(jù)蛋白質(zhì)的特性來摸索具體的方案。附溶液配方：GuNTA-0 Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 6M

11、Guanidium HClGuNTA-20 Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 6M Guanidium HCl, 20mM ImidazoleGuNTA-40 Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 6M Guanidium HCl, 40mM Imidazole GuNTA-60Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 6M Guanidium HCl, 60mM ImidazoleGuNTA

12、-100Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 6M Guanidium HCl, 100mM ImidazoleGuNTA-500 Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 6M Guanidium HCl, 500mM Imidazole附： NTA 樹脂的再生NTA 樹脂在使用若干次數(shù)( 3-5 次)后，結(jié)合效率有所下降，可以用以下方法再生，提高樹 脂的使用壽命和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率。注意： NTA 樹脂再生前需要從層析柱下端流干所有溶 液，估計出 NTA 的樹脂

13、體積，按下列次序?qū)⒃偕噭┘拥綄游鲋铮诘壬弦辉偕芤毫鞲珊?，再加下一再生溶解。用戶需要自行?zhǔn)備25%,50%,75% ，100%(v/v )乙醇和去離子水。NTA 再生步驟：(1) 從層析柱下端流干所有溶液， 用2倍NTA樹脂體積的0.2M Acetic Acid/6M guanidine HCI 洗。(2) 用 2倍體積的去離子水洗。(3) 用 3倍體積的 2% SDS 洗。( 4)用 1 倍體積的 25%乙醇洗。( 5)用 1 倍體積的 50%乙醇洗。( 6)用 1 倍體積的 75%乙醇洗。(7)用 5倍體積的 1 00%乙醇洗。( 8)用 1 倍體積的 75%乙醇洗。( 9)用 1 倍體積的 50%乙醇洗。( 10 )用 1 倍體積的 25%乙醇洗。