序列分析軟件DNAMAN_的使用方法中文

1、精選課件1序列分析軟件序列分析軟件DNAMAN 的的使用方法簡(jiǎn)介使用方法簡(jiǎn)介 饒志明饒志明 博士/教授 博士生導(dǎo)師江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)微生物中心江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)微生物中心江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室E-mail: 精選課件2nDNAMAN 是一種常用的核酸序列分析是一種常用的核酸序列分析軟件。由于它功能強(qiáng)大，使用方便，已軟件。由于它功能強(qiáng)大，使用方便，已成為一種普遍使用的成為一種普遍使用的DNA 序列分析工具。序列分析工具。 精選課件3打開(kāi)打開(kāi)DNAMAN，可以看到如下界面：，可以看到如下界面：n 第一欄為主菜單欄。除了幫助菜單外，有十第

2、一欄為主菜單欄。除了幫助菜單外，有十個(gè)常用主菜單，個(gè)常用主菜單，n第二欄為工具欄：第二欄為工具欄：n第三欄為瀏覽器欄：第三欄為瀏覽器欄： 在瀏覽器欄下方的工作在瀏覽器欄下方的工作區(qū)左側(cè)，可見(jiàn)區(qū)左側(cè)，可見(jiàn)Channel 工具條，工具條，DNAMAN 提提供供20 個(gè)個(gè)Channel，點(diǎn)擊，點(diǎn)擊Channel 工具條上相工具條上相應(yīng)的數(shù)字，即可擊活相應(yīng)的應(yīng)的數(shù)字，即可擊活相應(yīng)的Channel。n每個(gè)每個(gè)Channel 可以裝入一個(gè)序列。將要分析可以裝入一個(gè)序列。將要分析的序列（的序列（DNA 序列或氨基酸序列）放入序列或氨基酸序列）放入Channel 中可以節(jié)約存取序列時(shí)間，加快分中可以節(jié)約存取序

3、列時(shí)間，加快分析速度。析速度。精選課件4精選課件5如何使用如何使用DNAMAN 分析序列分析序列 n1將待分析序列裝入將待分析序列裝入Channel n通過(guò)通過(guò)File Open 命令打開(kāi)待分析序列文件，則命令打開(kāi)待分析序列文件，則打開(kāi)的序列自動(dòng)裝入默認(rèn)打開(kāi)的序列自動(dòng)裝入默認(rèn)Channel。n通過(guò)通過(guò)Sequence/Load Sequence 菜單的子菜菜單的子菜單打開(kāi)文件或?qū)⑦x定的部分序列裝入單打開(kāi)文件或?qū)⑦x定的部分序列裝入Channel 。n通過(guò)通過(guò)Sequence/Current Sequence/Analysis Defination 命令打開(kāi)命令打開(kāi)一個(gè)對(duì)話框，通過(guò)此對(duì)話框可以設(shè)定

4、序列的性一個(gè)對(duì)話框，通過(guò)此對(duì)話框可以設(shè)定序列的性質(zhì)（質(zhì)（DNA 或蛋白質(zhì)），名稱，要分析的片段或蛋白質(zhì)），名稱，要分析的片段等參數(shù)。等參數(shù)。精選課件62 以不同形式顯示序列以不同形式顯示序列 n通過(guò)通過(guò)Sequence/Display Sequence 命令打開(kāi)對(duì)話框，命令打開(kāi)對(duì)話框，n根據(jù)不同的需要，可以選擇顯示不同的根據(jù)不同的需要，可以選擇顯示不同的序列轉(zhuǎn)換形式。序列轉(zhuǎn)換形式。n對(duì)話框選項(xiàng)說(shuō)明如下：對(duì)話框選項(xiàng)說(shuō)明如下：nSequence &Composition 顯示序列和顯示序列和成分成分 精選課件72 以不同形式顯示序列以不同形式顯示序列nReverse Complement Sequ

5、ence 顯示待分顯示待分析序列的反向互補(bǔ)序列析序列的反向互補(bǔ)序列 nReverse Sequence 顯示待分析序列的反向顯示待分析序列的反向序列序列 nComplement Sequence 顯示待分析序列的顯示待分析序列的互補(bǔ)序列互補(bǔ)序列 nDouble Stranded Sequence 顯示待分析序顯示待分析序列的雙鏈序列列的雙鏈序列 nRNA Sequence 顯示待分析序列的對(duì)應(yīng)顯示待分析序列的對(duì)應(yīng)RNA 序列序列精選課件83DNA 序列的限制性酶切位點(diǎn)分析序列的限制性酶切位點(diǎn)分析n將待分析的序列裝入將待分析的序列裝入Channel，點(diǎn)擊要分析的，點(diǎn)擊要分析的Channel，然后

6、通過(guò)，然后通過(guò)Restriction/Analysis 命令打開(kāi)命令打開(kāi)對(duì)話框，對(duì)話框，n參數(shù)說(shuō)明如下：參數(shù)說(shuō)明如下：nResults 分析結(jié)果顯示分析結(jié)果顯示n其中包括：其中包括：nShow summary（顯示概要）（顯示概要） nShow sites on sequence（在結(jié)果中顯示酶切位點(diǎn)）（在結(jié)果中顯示酶切位點(diǎn)） nDraw restriction map（顯示限制性酶切圖）（顯示限制性酶切圖）nDraw restriction pattern（顯示限制性酶切模式圖）（顯示限制性酶切模式圖） 精選課件93DNA 序列的限制性酶切位點(diǎn)分析序列的限制性酶切位點(diǎn)分析nIgnore en

7、zymes with more than（忽略大于某設(shè)（忽略大于某設(shè)定值的酶切位點(diǎn)）定值的酶切位點(diǎn)）nIgnore enzymes with less than（忽略小于某設(shè)定（忽略小于某設(shè)定值的酶切位點(diǎn)）值的酶切位點(diǎn)）nTarget DNA （目標(biāo)（目標(biāo)DNA 特性）特性） nCircular（環(huán)型（環(huán)型DNA），），ndam/dcm methylation（dam/dcm 甲基化）甲基化）nall DNA in Sequence Channel（選擇此項(xiàng)，在（選擇此項(xiàng)，在Sequence Channel 中的所有序列將被分析，如果選中的所有序列將被分析，如果選擇了擇了Draw restri

8、ction pattern，那么當(dāng)所有的，那么當(dāng)所有的channel 中共有兩條中共有兩條DNA 時(shí)，則只能選擇兩個(gè)酶分時(shí)，則只能選擇兩個(gè)酶分析，如果共有三個(gè)以上析，如果共有三個(gè)以上DNA 時(shí)，則只能用一個(gè)酶分時(shí)，則只能用一個(gè)酶分析。）析。）精選課件10n選擇所需的項(xiàng)目，然后按提示操作點(diǎn)擊按扭，出現(xiàn)下選擇所需的項(xiàng)目，然后按提示操作點(diǎn)擊按扭，出現(xiàn)下列對(duì)話框：列對(duì)話框： n參數(shù)說(shuō)明如下：參數(shù)說(shuō)明如下： nEnzymen代表（代表（enzyme data file），點(diǎn)擊旁邊的下拉按鈕，），點(diǎn)擊旁邊的下拉按鈕，出現(xiàn)兩個(gè)默認(rèn)選項(xiàng)，出現(xiàn)兩個(gè)默認(rèn)選項(xiàng)，restrict.enz 和和dnamane.enz，

9、 n如果添加過(guò)自制的酶列表，則附加顯示自制酶列表文如果添加過(guò)自制的酶列表，則附加顯示自制酶列表文件名。件名。n其中其中restrict.enz 數(shù)據(jù)文件包含數(shù)據(jù)文件包含180 種限制酶，種限制酶，dnamane.enz 數(shù)據(jù)文件包含數(shù)據(jù)文件包含2524 種限制酶。種限制酶。n選擇其中一個(gè)數(shù)據(jù)文件，相應(yīng)的酶在左邊的顯示框中選擇其中一個(gè)數(shù)據(jù)文件，相應(yīng)的酶在左邊的顯示框中列出（按酶名稱字母表順序），鼠標(biāo)雙擊酶名稱，則列出（按酶名稱字母表順序），鼠標(biāo)雙擊酶名稱，則對(duì)應(yīng)的酶被選中，在右邊空白框中列出。對(duì)應(yīng)的酶被選中，在右邊空白框中列出。精選課件11n要自制酶切列表，可以從左邊酶列表中雙擊鼠標(biāo)選擇多種酶（

10、例要自制酶切列表，可以從左邊酶列表中雙擊鼠標(biāo)選擇多種酶（例如如puc18 multiple cloning sites），），n然后點(diǎn)擊按鈕出現(xiàn)下列對(duì)話框：然后點(diǎn)擊按鈕出現(xiàn)下列對(duì)話框：n輸入要保存酶列表的文件名，點(diǎn)擊按鈕即可保存。自制酶列表可輸入要保存酶列表的文件名，點(diǎn)擊按鈕即可保存。自制酶列表可以方便分析特定的酶切位點(diǎn)。以方便分析特定的酶切位點(diǎn)。nCutter 酶切識(shí)別序列長(zhǎng)度；酶切識(shí)別序列長(zhǎng)度；nEnd 酶切產(chǎn)生的末端，其中包括，酶切產(chǎn)生的末端，其中包括，nBlunt（平頭末端），（平頭末端），n5Overhang（5突出粘性末端）突出粘性末端）,n3Overhang(3突出粘性末端突出粘

11、性末端)，n系統(tǒng)根據(jù)系統(tǒng)根據(jù)cutter 和和end 的設(shè)定情況的設(shè)定情況,在左邊酶列表中顯示符合條在左邊酶列表中顯示符合條件的酶。最后，點(diǎn)擊按鈕執(zhí)行操作。件的酶。最后，點(diǎn)擊按鈕執(zhí)行操作。精選課件124DNA 序列比對(duì)分析序列比對(duì)分析（Dot Matrix Comparision）n要比較兩個(gè)序列，可以使用要比較兩個(gè)序列，可以使用DNAMAN 提供的序列比對(duì)工具提供的序列比對(duì)工具Dot Matrix Comparision （點(diǎn)矩陣比較）通過(guò)（點(diǎn)矩陣比較）通過(guò)Sequense/Dot matrix comparision 命令打開(kāi)比對(duì)界面，命令打開(kāi)比對(duì)界面， n點(diǎn)擊對(duì)比界面左上角的按鈕，出現(xiàn)下

12、列點(diǎn)擊對(duì)比界面左上角的按鈕，出現(xiàn)下列對(duì)話框：對(duì)話框： 精選課件13參數(shù)說(shuō)明如下： nSequence type 序列類型序列類型 nSequence 1 參加比對(duì)的第一序列選擇框，框內(nèi)選項(xiàng)參加比對(duì)的第一序列選擇框，框內(nèi)選項(xiàng)說(shuō)明如下：說(shuō)明如下：n如果要比對(duì)的序列在如果要比對(duì)的序列在Channel 中，點(diǎn)擊下拉箭頭，選中，點(diǎn)擊下拉箭頭，選擇相應(yīng)的擇相應(yīng)的Channel，則被選中的，則被選中的Channel 中的序列作中的序列作為參加比對(duì)的第一序列；為參加比對(duì)的第一序列；n也可以從文件夾中選擇參加比對(duì)的序列，在也可以從文件夾中選擇參加比對(duì)的序列，在File 選擇選擇框上點(diǎn)擊即可。通過(guò)框上點(diǎn)擊即可。通

13、過(guò)Length 選擇參加比對(duì)的序列片選擇參加比對(duì)的序列片段。段。nSequence 2 參加比對(duì)的第二序列選擇框；選項(xiàng)說(shuō)明參加比對(duì)的第二序列選擇框；選項(xiàng)說(shuō)明同上同上 nShow Sequence 選擇此項(xiàng)，當(dāng)同源性大于設(shè)定值時(shí)，選擇此項(xiàng)，當(dāng)同源性大于設(shè)定值時(shí)，將顯示同源性；將顯示同源性； 精選課件14nAnnotations 是否顯示注釋是否顯示注釋 nComparision 比對(duì)參數(shù)，比對(duì)參數(shù)，n其中其中Window 代表代表Window size（單位比對(duì)長(zhǎng)度），（單位比對(duì)長(zhǎng)度），nMismatch 代表代表Mismatch size（單位比對(duì)長(zhǎng)度中許（單位比對(duì)長(zhǎng)度中許可的錯(cuò)配值）要快速比

14、對(duì)，需將此項(xiàng)設(shè)為可的錯(cuò)配值）要快速比對(duì)，需將此項(xiàng)設(shè)為0。nBoth stran 代表代表Both strand（雙鏈比對(duì)）選擇此項(xiàng)，（雙鏈比對(duì)）選擇此項(xiàng)，是指用是指用Sequence 2 中的序列的正鏈和負(fù)鏈分別和中的序列的正鏈和負(fù)鏈分別和Sequence 1 比較。比較。nSequence 2 正鏈與正鏈與Sequence 1 比較結(jié)果用黑色點(diǎn)比較結(jié)果用黑色點(diǎn)表示，表示，Sequence 2 負(fù)鏈比對(duì)結(jié)果用紅色點(diǎn)表示。負(fù)鏈比對(duì)結(jié)果用紅色點(diǎn)表示。 精選課件15nPlot box 點(diǎn)陣圖表顯示參數(shù)，點(diǎn)陣圖表顯示參數(shù)，nPosition（起點(diǎn)坐標(biāo)）（起點(diǎn)坐標(biāo)）nWidth（寬度值）（寬度值）nHe

15、ight（高度值）（高度值）nFrame size（邊框線粗度值）（邊框線粗度值）nDot size（點(diǎn)粗度值）（點(diǎn)粗度值）nGridline（虛線框數(shù)）。（虛線框數(shù)）。 n參數(shù)設(shè)定好后，點(diǎn)擊按鈕執(zhí)行操作。參數(shù)設(shè)定好后，點(diǎn)擊按鈕執(zhí)行操作。 精選課件165序列同源性分析序列同源性分析n（1）兩序列同源性分析）兩序列同源性分析n通過(guò)通過(guò)Sequence/Two Sequence Alignment 命令打命令打開(kāi)對(duì)話框，如下所示：開(kāi)對(duì)話框，如下所示： n參數(shù)說(shuō)明如下：參數(shù)說(shuō)明如下： nAlignment method 比對(duì)方法，比對(duì)方法，n通常可選通?？蛇xQuick(快速比對(duì)快速比對(duì))或或Smit

16、h&Waterman(最最佳比對(duì)佳比對(duì))，n當(dāng)選擇快速比對(duì)時(shí)，設(shè)置較小的當(dāng)選擇快速比對(duì)時(shí)，設(shè)置較小的k-tuple 值，可以提值，可以提高精確度，高精確度，n當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，一般要設(shè)置較大的當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，一般要設(shè)置較大的k-tuple 值。值。k-tuple 值可選范圍值可選范圍26；n蛋白質(zhì)序列：蛋白質(zhì)序列：k-tuple 值可選范圍值可選范圍13。 精選課件17（2）多序列同源性分析）多序列同源性分析n通過(guò)打開(kāi)通過(guò)打開(kāi)Sequence/Multiple Sequence Alignment 命令打開(kāi)對(duì)話框，命令打開(kāi)對(duì)話框，n參數(shù)說(shuō)明如下：參數(shù)說(shuō)明如下：nFile 從文件中選擇參加比對(duì)的序列從

17、文件中選擇參加比對(duì)的序列nFolder 從文件夾中選擇參加比對(duì)的序列從文件夾中選擇參加比對(duì)的序列nChannel 從從channel 中選擇參加比對(duì)的序列中選擇參加比對(duì)的序列 nDbase 從數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇參加比對(duì)的序列從數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇參加比對(duì)的序列 nRemove 清除選擇的序列（鼠標(biāo)點(diǎn)擊左邊顯示框中的清除選擇的序列（鼠標(biāo)點(diǎn)擊左邊顯示框中的序列名選擇）序列名選擇）nClear 清除全部序列清除全部序列 精選課件18n點(diǎn)擊按鈕，出現(xiàn)方法選擇對(duì)話框：點(diǎn)擊按鈕，出現(xiàn)方法選擇對(duì)話框：n選擇其中一種方法，點(diǎn)擊按鈕，出現(xiàn)下列對(duì)話框：選擇其中一種方法，點(diǎn)擊按鈕，出現(xiàn)下列對(duì)話框： n如果在前一對(duì)話框選擇的是如果

18、在前一對(duì)話框選擇的是Fast alignment,則在此對(duì)話框中選則在此對(duì)話框中選擇擇Quick alignment,否則選擇否則選擇 Dynamic alignment 即可。其即可。其它參數(shù)不必改變，點(diǎn)擊對(duì)話框中間的使其它參數(shù)取原始默認(rèn)值。它參數(shù)不必改變，點(diǎn)擊對(duì)話框中間的使其它參數(shù)取原始默認(rèn)值。 n點(diǎn)擊左上角按鈕，可以從彈出的對(duì)話框中選擇不同的結(jié)果顯示特點(diǎn)擊左上角按鈕，可以從彈出的對(duì)話框中選擇不同的結(jié)果顯示特性選項(xiàng)。點(diǎn)擊按鈕下的按鈕，出現(xiàn)下列選擇項(xiàng)：性選項(xiàng)。點(diǎn)擊按鈕下的按鈕，出現(xiàn)下列選擇項(xiàng)： 可以通過(guò)這些選項(xiàng)，繪制同源關(guān)系圖（例如可以通過(guò)這些選項(xiàng)，繪制同源關(guān)系圖（例如Tree/homolo

19、gy tree 命令）。命令）。n顯示蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)（顯示蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)（Protein Secondary Structure 命令），命令），n繪制限制性酶切圖（繪制限制性酶切圖（Restriction Analysis 命令）等。命令）等。精選課件196.PCR 引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)n首先，將目標(biāo)首先，將目標(biāo)DNA 片段裝入片段裝入Channel,并激活并激活Channel。n點(diǎn)擊主菜單欄中的點(diǎn)擊主菜單欄中的Primer 主菜單，出現(xiàn)下拉菜單，主菜單，出現(xiàn)下拉菜單，n點(diǎn)擊點(diǎn)擊Design PCR Primers for DNA 命令，出現(xiàn)下列對(duì)話框：命令，出現(xiàn)下列對(duì)話框： 參數(shù)說(shuō)明如下：參數(shù)

20、說(shuō)明如下： nPrimer locations on target 引物定位引物定位 n其中包括下列選項(xiàng)：其中包括下列選項(xiàng)：nProduct size（擴(kuò)增目的片段大小）（擴(kuò)增目的片段大小）nSense primer (正向引物選擇區(qū)正向引物選擇區(qū)) nAntisense primer(反向引物選擇區(qū)反向引物選擇區(qū)) nPrimer 引物特性包括引物特性包括Length(引物長(zhǎng)度引物長(zhǎng)度)，Tm 值值, GC 含量等參含量等參數(shù)；數(shù)； nReject primer 引物過(guò)濾（將符合引物過(guò)濾條件的引物過(guò)濾掉）引物過(guò)濾（將符合引物過(guò)濾條件的引物過(guò)濾掉）精選課件20n包括下列選項(xiàng)：包括下列選項(xiàng)：n3

21、dimer(可形成可形成3端自我互補(bǔ)的堿基數(shù)端自我互補(bǔ)的堿基數(shù)) nHairpin stem(可形成發(fā)卡頸環(huán)結(jié)構(gòu)的堿基數(shù)可形成發(fā)卡頸環(huán)結(jié)構(gòu)的堿基數(shù))nPolyN(多聚堿基多聚堿基) n3Uique(3端嚴(yán)格配對(duì)堿基數(shù)端嚴(yán)格配對(duì)堿基數(shù)) nAll matches(引物互補(bǔ)配對(duì)百分?jǐn)?shù)引物互補(bǔ)配對(duì)百分?jǐn)?shù))nConsentrations 濃度設(shè)定濃度設(shè)定nProduct for hybridyzatnPCR 產(chǎn)物用于產(chǎn)物用于Southern Blot 探針雜交探針雜交 精選課件217畫(huà)質(zhì)粒模式圖畫(huà)質(zhì)粒模式圖n我們常常要用到各種質(zhì)粒圖，無(wú)論是制作幻燈片，還是發(fā)表文章，我們常常要用到各種質(zhì)粒圖，無(wú)論是制作

22、幻燈片，還是發(fā)表文章，常常需要質(zhì)粒圖。常常需要質(zhì)粒圖。DNAMAN 提供強(qiáng)大的繪質(zhì)粒圖功能，能滿足提供強(qiáng)大的繪質(zhì)粒圖功能，能滿足我們的需要。我們的需要。 n通過(guò)通過(guò)Restriction/Draw map 命令打開(kāi)質(zhì)粒繪圖界面：命令打開(kāi)質(zhì)粒繪圖界面： 將鼠標(biāo)移動(dòng)到圓圈上，等鼠標(biāo)變形成將鼠標(biāo)移動(dòng)到圓圈上，等鼠標(biāo)變形成“I”時(shí)，單擊鼠標(biāo)左鍵，出時(shí)，單擊鼠標(biāo)左鍵，出現(xiàn)如下菜單：現(xiàn)如下菜單： n菜單說(shuō)明如下：菜單說(shuō)明如下：nPosition 當(dāng)前位置當(dāng)前位置nAdd Site 添加酶切位點(diǎn)添加酶切位點(diǎn)nAdd Element 添加要素添加要素nAdd Text 添加文字添加文字nInsert Frag

23、ment 插入片斷插入片斷nCopy Fragment 復(fù)制片斷復(fù)制片斷nCut Fragment 剪切片斷剪切片斷 nRemove Fragment 清除片斷清除片斷nFrame Thickness 邊框線粗細(xì)調(diào)節(jié)邊框線粗細(xì)調(diào)節(jié) 精選課件22n點(diǎn)擊點(diǎn)擊Add Site 選項(xiàng)，出現(xiàn)對(duì)話框：選項(xiàng)，出現(xiàn)對(duì)話框： n參數(shù)說(shuō)明如下：參數(shù)說(shuō)明如下：nName 要添加的酶切位點(diǎn)的名稱要添加的酶切位點(diǎn)的名稱(例如例如HindIII) nPosition 位置（以堿基數(shù)表示）位置（以堿基數(shù)表示）n點(diǎn)擊點(diǎn)擊Add Element 選項(xiàng)，出現(xiàn)如下對(duì)話框：選項(xiàng)，出現(xiàn)如下對(duì)話框： 參數(shù)說(shuō)明如下：參數(shù)說(shuō)明如下：nTyp

24、e 要素類型（共有三種類型，鼠標(biāo)點(diǎn)擊即可切換）要素類型（共有三種類型，鼠標(biāo)點(diǎn)擊即可切換） nColor/Pattern 填充色（共有填充色（共有16 種顏色供選擇）種顏色供選擇） nName 要素名稱要素名稱nStart /End/Size 要素起點(diǎn)要素起點(diǎn)/終點(diǎn)終點(diǎn)/粗細(xì)度粗細(xì)度 精選課件23核酸序列的一般分析流程核酸序列的一般分析流程 精選課件24n1.1 核酸序列的檢索核酸序列的檢索 :80/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide 1.2 核酸序列的同源性分析核酸序列的同源性分析 n1.2.1 基于基于NCBI/

25、Blast軟件的核酸序列同源性分析軟件的核酸序列同源性分析 /blast/blast.cgi 1.2.2 核酸序列的兩兩比較核酸序列的兩兩比較 /gorf/bl2.html n1.2.3 核酸序列的批量聯(lián)網(wǎng)同源性分析核酸序列的批量聯(lián)網(wǎng)同源性分析(方案方案)精選課件25n1.3 核酸序列的電子延伸核酸序列的電子延伸 1.3.1 利用利用UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行電子延伸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行電子延伸(方案方案) n1.3.2 利用利用Tigem的的EST Machine進(jìn)行電子延伸進(jìn)行電子延伸 EST Ex

26、tractor: http:/gcg.tigem.it/blastextract/estextract.html | EST Assembly: http:/www.tigem/ESTmachine.html 1.3.3 利用利用THC數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)核酸序列進(jìn)行電子延伸數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)核酸序列進(jìn)行電子延伸 http:/gcg.tigem.it/UNIBLAST/uniblast.html精選課件26n1.4 核酸序列的開(kāi)放閱讀框架分析核酸序列的開(kāi)放閱讀框架分析 1.4.1基于基于NCBI/ORF finder的的ORF分析分析 /gorf/gorf.htm

27、l n1.5 基因的電子表達(dá)譜分析基因的電子表達(dá)譜分析 n1.5.1 利用利用UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行電子表達(dá)譜分析（方數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行電子表達(dá)譜分析（方案）案）n1.5.2利用利用Tigem的電子原位雜交服務(wù)器進(jìn)行電子表達(dá)的電子原位雜交服務(wù)器進(jìn)行電子表達(dá)譜分析譜分析 http:/gcg.tigem.it/INSITU/insitublast.html精選課件27n1.6 核酸序列的電子基因定位分析核酸序列的電子基因定位分析 1.6.1 利用利用STS數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行電子基因定位數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行電子基因定位 /genome/sts/epcr.cgi 1.6.2

28、 利用利用UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行電子基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行電子基因定位（方案）定位（方案） 精選課件28n1.7 cDNA的基因組序列分析的基因組序列分析 1.7.1 通過(guò)從通過(guò)從NCBI查詢部分基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因組查詢部分基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因組序列的分析序列的分析(方案方案) 1.7.2 通過(guò)從通過(guò)從NCBI查詢?nèi)炕蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因組查詢?nèi)炕蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因組序列的分析序列的分析 /genome/seq/page.cgi?F=HsBlast.html&ORG=Hs 1.7.3 通過(guò)從通過(guò)從Sanger Centre查詢基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行查

29、詢基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因組序列的分析基因組序列的分析 http:/www.sanger.ac.uk/HGP/blast_server.shtml 精選課件29n1.8 基因組序列的初步分析基因組序列的初步分析 1.8.1 基因組序列的內(nèi)含子基因組序列的內(nèi)含子/外顯子分析外顯子分析 /urllists/genefind.htm 1.8.2 基因組序列的啟動(dòng)子分析基因組序列的啟動(dòng)子分析 /projects/promoter.html 精選課件30n1.9核酸序列的注冊(cè) 1.9.1 EST序列的注冊(cè)(方案) 1.

30、9.2 較長(zhǎng)或全長(zhǎng)cDNA序列的注冊(cè)(方案)n1.10待分析序列所對(duì)應(yīng)的已知克隆的獲取 精選課件31引 物 設(shè) 計(jì)n引物n引物的重要性n引物設(shè)計(jì)的原則n引物與PCRn引物設(shè)計(jì)軟件n如何使用Primer Premier 5.0n引物同源性分析精選課件32引物（primers)n引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個(gè)引物與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ)，另一個(gè)引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)。3355Sense primerAntisense primer精選課件33引物的重要性n在整個(gè)PCR體系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特

31、異性要求引物與靶DNA特異結(jié)合，不與其他非目的DNA結(jié)合，PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能對(duì)引物進(jìn)行有效的延伸，可見(jiàn)引物設(shè)計(jì)好壞與PCR結(jié)果密切相關(guān)。精選課件34引物設(shè)計(jì)原則n引物長(zhǎng)度 n堿基分布的均衡性nTm值n引物二級(jí)結(jié)構(gòu)n引物3端n引物5端n引物的內(nèi)部穩(wěn)定性n引物的保守性與特異性n擴(kuò)增區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)精選課件35引物長(zhǎng)度 n一般為15-30個(gè)核苷酸，在做長(zhǎng)片段PCR或做某些特殊的PCR時(shí)應(yīng)使用較長(zhǎng)的引物，但最多不超過(guò)50個(gè)核苷酸。精選課件36堿基分布的均衡性n同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應(yīng)超過(guò)5個(gè)nGC含量一般40-60%nGC含量太低導(dǎo)致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性n

32、GC含量太高也易于引發(fā)非特異擴(kuò)增。精選課件37引物Tm值n一般要求：55-65。n計(jì)算：n對(duì)于低于20個(gè)堿基的引物，Tm值可根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)來(lái)粗略估算n對(duì)于較長(zhǎng)引物，Tm值則需要考慮熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)，從“最近鄰位”的計(jì)算方式得到，這也是現(xiàn)有的引物設(shè)計(jì)軟件最常用的計(jì)算方式。nTm = H/( S + R * ln (C/4) + 16.6 log (K+/(1 + 0.7 K+) - 273.15精選課件38引物二級(jí)結(jié)構(gòu)n引物二聚體n盡可能避免兩個(gè)引物分子之間3端有有較多堿基互補(bǔ)n發(fā)夾結(jié)構(gòu)n尤其是要避免引物3端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，否則將嚴(yán)重影響DNA聚合酶的延伸。精選課件39引物3端n

33、引物的延伸從3端開(kāi)始，因此3端的幾個(gè)堿基與模板DNA均需嚴(yán)格配對(duì)，不能進(jìn)行任何修飾，否則不能進(jìn)行有效的延伸，甚至導(dǎo)致PCR擴(kuò)增完全失敗?？紤]到密碼子的簡(jiǎn)并性，引物3端最后一個(gè)堿基最好不與密碼子第三個(gè)堿基配對(duì)。精選課件40引物5端n引物5端可以有與模板DNA不配對(duì)堿基，在5端引入一段非模板依賴性序列。n5端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)序列（酶切位點(diǎn)5端加上適當(dāng)數(shù)量的保護(hù)堿基）。n5端的某一位點(diǎn)修改某個(gè)堿基，人為地在產(chǎn)物中引入該位點(diǎn)的點(diǎn)突變以作研究。n5端標(biāo)記放射性元素或非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛等）。精選課件41 引物的內(nèi)部穩(wěn)定性n過(guò)去認(rèn)為，引物3端應(yīng)牢牢結(jié)合在模板上才能有效地進(jìn)行延伸，故3端最

34、好為G或C。n現(xiàn)在的觀點(diǎn)認(rèn)為，引物的5端應(yīng)是相對(duì)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而3端在堿基配對(duì)的情況下最好為低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)，即3端盡可能選用A或T，少用G或C。n僅僅3端幾個(gè)堿基與非特異位點(diǎn)上的堿基形成的低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)是難以有效引發(fā)引物延伸的。n如果3端為富含G、C的結(jié)構(gòu)，只需3端幾個(gè)堿基與模板互補(bǔ)結(jié)合，就可能引發(fā)延伸，造成假引發(fā)。精選課件42引物的保守性與特異性n保守性：通用引物檢測(cè)同一類病原微生物盡可能多的型別n特異性：避免非特異性擴(kuò)增精選課件43擴(kuò)增區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)n模板DNA的某些區(qū)域具有高度復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在選擇引物時(shí)，應(yīng)使擴(kuò)增區(qū)域盡可能避開(kāi)這些區(qū)域。n擴(kuò)增區(qū)域的自由能（G。）小于58.61kJ/moln引物Tm值與PCR產(chǎn)物Tm值相差一般不超過(guò)30nTm product = 81.5 + 16.6 log (K+/(1+0.7K+) + 0.41 (%G + %C) - 500/length精選課件44引物與PCRn引物濃度：一般為0.1-0.5umol/Ln引物濃度(uM)=n OD33/（A312C288G328T303-61）/VH2O VH2O (單位：L)n退火溫度n最適退火溫度（Ta Opt ） = 0.3 (Tm of primer) + 0.7 (Tm of produ