八種常用化療藥物組合對人類宮頸癌細(xì)胞體外藥物敏感試驗研究

1、八種常用化療藥物組合對人類宮頸癌細(xì)胞體外藥物敏感試驗研究【摘要】目的：探討臨床宮頸癌原代腫瘤細(xì)胞對八種常用化療藥物組合方案的敏感性。方法 :采用ATP生物熒光法,對41例宮頸癌術(shù)中切下腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng),再將紫杉醇，紫杉醇+順鉑，紫杉醇+卡鉑，托泊替康+順鉑，吉西他濱+順鉑，多西他賽；吉西他濱以及順鉑+環(huán)磷酰胺+多柔比星分別設(shè)定不同藥物濃度梯度（200%，100%，50.0%，25.0%，12.5%PPC即血漿峰值濃度），進(jìn)行藥敏試驗。結(jié)果：8組化療藥物方案對宮頸癌的敏感性依次為：紫杉醇+順鉑>紫杉醇+卡鉑>紫杉醇>吉西他濱+順鉑>順鉑+環(huán)磷酰胺+多柔比星&g

2、t;托泊替康+順鉑>多西他賽>吉西他濱。結(jié)論：宮頸癌患者進(jìn)行化療藥物敏感試驗具有可行性,對臨床個體化化療具有現(xiàn)實指導(dǎo)作用?！娟P(guān)鍵詞】宮頸癌；原代腫瘤細(xì)胞；化療藥物；敏感性；體外培養(yǎng)Eight Anticancer Drug Sensitivity Test of Cervical Carcinomas by ATP-bioluminesence method【Abstract】：Objective :To evaluate chemosensitivity of cervical carcinoma to 8 anticancer drugs were assayed in vit

3、ro using ATP- bioluminesence method. Methods: The chemosensitivity of 40 fresh specimens of human cervical tumors were tested with ATP-bioluminesence and eight anticancer drugs.Results: Chemosensitivities of cervical carcinoma to 8 anticancer drugs priority is :TAX+DDP>TAX+CBP>TAX>GEM+DDP&g

4、t;DDP+CTX+ADM> Topotecan+DDP>Docetaxel>GEM. Conclusion :The ATP-bioluminesence assay in vitro can predict chemotherapy for cervical carcinoma.Key words:cervical carcinoma; pro-generation tumor cells; chemotreatm-ent drug; susceptiveness; cultivation in vitro .宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居婦科惡性腫瘤之

5、首。近年來發(fā)病率呈上升和年輕化趨勢。宮頸癌的治療模式為手術(shù)及放療，化療僅僅用于不能手術(shù)的晚期患者的姑息治療或手術(shù)前新輔助治療1。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，臨床治療的不斷深入，醫(yī)療工作者發(fā)現(xiàn)手術(shù)和放療不能控制和消除亞臨床病灶和微小轉(zhuǎn)移病灶。隨著化療藥物的不斷更新?lián)Q代、里程碑式的跨越，給藥方法和給藥途徑的不斷改善。選擇針對個體有效的藥物進(jìn)行化療是治療婦科惡性腫瘤的重要手段之一。本研究通過參考近年來國內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)23選擇八種一線及二線的宮頸癌化療藥物方案，化療前對個體宮頸癌細(xì)胞進(jìn)行藥物體外敏感試驗，對其細(xì)胞毒性進(jìn)行比較,選擇出有效的單藥或有效（或敏感）聯(lián)合藥物組成的化療方案，為臨床個體化化療提供依據(jù)。

6、1. 材料與方法1.1 一般資料 收集2013年-2014年在本院手術(shù)治療的宮頸癌（經(jīng)病理確診）患者41例標(biāo)本，最小年齡24歲，最大年齡68歲。其中鱗癌32例；腺癌8例；宮頸腺泡狀橫紋肌肉瘤1例。1.2 材料 ATP-TCA11試劑盒，由湖州海創(chuàng)生物科技有限公司提供?；熕幬铮鹤仙即迹═AX，百時美施貴寶公司），順鉑4(DDP，江蘇豪森藥業(yè))，卡鉑5(CBP, 齊魯制藥)，托泊替康6（Topotecan，葛蘭素史克），吉西他濱7（GEM,ELI LILLY AND COMPANY），多西他賽8（Docetaxel,江蘇恒瑞醫(yī)藥）；環(huán)磷酰胺（CTX，Toronto Research Chemic

7、als Inc.），多柔比星9（ADM，深圳萬樂藥業(yè)）。均為一般臨床制劑。其濃度依據(jù)臨床用藥的有效血藥濃度確定。具體試驗濃度如表一。 表一 八種化療藥物試驗濃度藥物TAXDDPCBPTopotecanGEM DocetaxelCTXADM100%PPC（ug/ml）13.86.3250.752510331.3 方法 ATP-TCA操作步驟：取手術(shù)切除的新鮮腫瘤組織標(biāo)本，去除其表面的凝血塊及壞死組織等，剪碎、離心，加入組織消化酶溶液，充分消化后離心，去上清，收集細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1030萬/ml,加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,置37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后,加入化療藥物,每個藥物設(shè)5個濃

8、度(200%，100%，50.0%，25.0%，12.5%PPC),同時設(shè)空白對照(不含腫瘤細(xì)胞)及對照孔(含腫瘤細(xì)胞但不加化療藥物),于5%CO2、37、95%濕度下孵育57天。加入腫瘤細(xì)胞ATP提取液，混勻后室溫下15min，取0.05ml混合液置微板熒光分析儀檢測11。按下式計算各個化療藥物的抑制率：抑制率= (1-試驗孔ATP量/對照組ATP量)×100%抑制率70%為高度敏感；50%70%為敏感；30%50%為低度敏感；<30%為耐藥；當(dāng)抑制率50%時可以推薦臨床使用。2. 統(tǒng)計學(xué)方法 本試驗所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。 采用GraphPad P

9、rism 5.0軟件作圖。3. 結(jié)果3.1ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線10用于質(zhì)控，用于每次使用系統(tǒng)時的發(fā)光測試及實驗結(jié)果異常時的校驗。取各濃度測得的發(fā)光均值，以稀釋濃度的LG對數(shù)值為自變量，以測定結(jié)果均值的LG對數(shù)值為因變量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線確定線性度，在ATP標(biāo)準(zhǔn)品濃度10-1110-6mol/ml范圍內(nèi),二者呈良好的直線相關(guān)關(guān)系。相關(guān)系數(shù)r 0.975,對r進(jìn)行t檢驗,P<0.001。3.2 ATP生物發(fā)光法檢測結(jié)果 在總共收集的41例病人中，41例均具有可評估性?？偪稍u估率約為:100%。在血漿峰值濃度下藥物對宮頸鱗癌與腺癌的抑制率均值見表二。在血漿峰值濃度下藥物對宮頸鱗癌與腺癌的抑制率對照見圖一。

10、病理藥物TAXTCTPDocetaxelGEM+DDPDDP+CTX+ADMGEMTopotecan+DDP鱗癌腺癌89.7187.9893.8997.2998.0792.6265.1765.5875.2896.6070.6289.7046.6039.7071.5670.13表二：血漿峰值濃度下藥物對鱗癌與腺癌的抑制率均值（%） 圖一：血漿峰值濃度下藥物對鱗癌與腺癌的抑制率對照 另外，宮頸腺泡狀橫紋肌肉瘤1例的癌細(xì)胞藥物的敏感性：TAX單藥為高度敏感，TAX+CBP方案為敏感，DDP+CTX+ADM方案為低度敏感，其余均為耐藥。以上試驗結(jié)果顯示：在血漿峰值濃度下，對于宮頸鱗癌化療藥物的抑制率依

11、次為：TAX+DDP>TAX+CBP>TAX>GEM+DDP>Topotecan+DDP>DDP+CTX+ADM>Docetaxel>GEM。在血漿峰值濃度下，對于宮頸腺癌化療藥物的抑制率依次為：TAX+CBP>GEM+DDP>TAX+DDP>DDP+CTX+ADM>TAX>Topotecan+DDP>Docetaxel>GEM。然而，宮頸癌不同組織病理學(xué)藥物敏感性的差異根據(jù)SPSS軟件統(tǒng)計P=0.3360（P>0.05），差異尚不具有統(tǒng)計學(xué)意義。 資料收集的41例宮頸癌細(xì)胞在不同濃度梯度下八組藥物的腫瘤

12、生長抑制率均值（%）見表三，八組化療藥物對宮頸癌細(xì)胞體外敏感試驗結(jié)果對照見圖二。表三：不同濃度梯度下八組藥物的腫瘤生長抑制率均值濃度藥物TAXTCTPDocetaxelGEM+DDPDDP+CTX+ADM GEMTopotecan+DDP200%PPC100%PPC50%PPC25%PPC12.5PPC96.9889.31 71.4454.4342.1297.9594.4979.0559.0746.3599.3196.7186.1468.3748.9381.9465.3049.7440.1934.2481.5777.9469.7658.0244.6280.6475.1166.7248.3732

13、.0950.5726.6126.5126.5424.4276.0871.4159.7045.5236.42 圖二 八組化療藥物對宮頸癌細(xì)胞體外敏感試驗結(jié)果 試驗結(jié)果顯示：本試驗的八組化療藥物的敏感性與藥物的濃度呈正相關(guān)。隨著化療藥物的濃度增加，對腫瘤細(xì)胞敏感率也逐漸增加。當(dāng)濃度為200%PPC時，化療藥物的抑制率依次為：TAX+DDP>TAX+CBP>TAX>Docetaxel>GEM+DDP>DDP+CTX+ADM>Topotecan+DDP>GEM；當(dāng)濃度為100%PPC時，化療藥物的抑制率依次為：TAX+DDP>TAX+CBP>TAX

14、>GEM+DDP>DDP+CTX+ADM>Topotecan+DDP>Docetaxel>GEM；當(dāng)濃度為50%PPC時，化療藥物的抑制率依次為：TAX+DDP>TAX+CBP>TAX>GEM+DDP>DDP+CTX+ADM>Topotecan+DDP>Docetaxel>GEM；當(dāng)濃度為25%PPC時，化療藥物的抑制率依次為：TAX+DDP>TAX+CBP>GEM+DDP>TAX>DDP+CTX+ADM>Topotecan+DDP>Docetaxel>GEM；當(dāng)濃度為12.5%P

15、PC時，化療藥物的抑制率依次為：TAX+DDP>TAX+CBP>GEM+DDP>TAX>Topotecan+DDP>Docetaxel>DDP+CTX+ADM >GEM。 從總體的腫瘤抑制率的變化趨勢來看，八組化療藥物對個體宮頸癌細(xì)胞的抑制作用具有顯著性差異（P0.001），抑制率依次為：紫杉醇+順鉑>紫杉醇+卡鉑>紫杉醇>吉西他濱+順鉑>順鉑+環(huán)磷酰胺+多柔比星>托泊替康+順鉑>多西他賽>吉西他濱。4.討論經(jīng)典的的宮頸癌化療方案一般選擇：BVP（博來霉素、長春新堿與順鉑）、BP（博來霉素與順鉑）、FP（氟尿嘧

16、啶與順鉑）或者TP（紫杉醇與順鉑）。經(jīng)驗性選擇化療方案對宮頸癌細(xì)胞幾乎沒有選擇特異性，因而療效低，同時易產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)12；但是臨床上大多憑經(jīng)驗用藥，同一化療方案固定不變應(yīng)用于許多患者而忽視了個體差異，總體療效不佳。本研究采用ATP生物熒光法6對41例宮頸癌患者的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果顯示隨著藥物濃度的增大，腫瘤細(xì)胞對各抗癌藥物的敏感性增加，呈劑量依賴性。在患者可耐受的前提下可優(yōu)先選擇TAX+DDP方案，其次為TAX+CBP和單藥TAX方案。有些患者的腫瘤細(xì)胞對某些藥物非常敏感，在濃度為50%PPC 時就表現(xiàn)為高度敏感；而有些細(xì)胞則表現(xiàn)出耐藥，但隨著檢測藥物濃度的增加，當(dāng)在濃度達(dá)200%

17、PPC甚至更高時，細(xì)胞則表現(xiàn)出敏感。表明增加藥物劑量可以提高療效，這對于能夠耐受大劑量化療的患者有較好的指導(dǎo)意義。本試驗八組化療藥物對41例宮頸癌細(xì)胞的抑制作用具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P0.01），顯示同種腫瘤不同患者間存在個體差異，應(yīng)針對不同患者個體化給藥。Ling ZQ等13報道對食管癌患者進(jìn)行體外藥敏試驗為臨床治療提供合理的抗癌方案。OToole SA等14采用MTS法檢測子宮內(nèi)膜癌以及宮頸癌患者對化療藥物的敏感性，并對比藥敏試驗結(jié)果與臨床療效，發(fā)現(xiàn)兩者具有較好的相關(guān)性。因此，在臨床選擇化療方案前進(jìn)行體外藥物敏感試驗，檢測患者腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，根據(jù)藥敏試驗結(jié)果選擇合適化療方案，可

18、以顯著提高治療療效，減少不良反應(yīng)及預(yù)防多藥耐藥發(fā)生，從而延長患者生存期。本研究也存在一些不足之處，抗癌藥物的療效是許多作用的綜合結(jié)果，受體內(nèi)諸因素的調(diào)控和制約，體外細(xì)胞生長環(huán)境無法完全模擬腫瘤體內(nèi)環(huán)境，藥敏試驗只是藥物和細(xì)胞的直接作用，只是反應(yīng)了腫瘤一個階段，一部分細(xì)胞的情況，無法完全體現(xiàn)腫瘤的異質(zhì)性；臨床效果受用藥方法、劑量影響很大，體內(nèi)的藥物濃度及持續(xù)時間受給藥途徑、肝腎功能等各種因素影響,而試驗條件則無法選擇合適的濃度和作用時間與臨床完全一致；某些藥物需經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化或免疫系統(tǒng)介導(dǎo)發(fā)揮作用, 如環(huán)磷酰胺 15需經(jīng)過肝臟代謝轉(zhuǎn)化為有效物質(zhì)發(fā)揮作用,而體外藥敏試驗無法很好體現(xiàn)這些藥物功效。另外，

19、據(jù)本研究結(jié)果顯示宮頸癌不同組織病理學(xué)間的藥物敏感性差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，可能與宮頸腺癌的樣本量少有關(guān)，有待后期繼續(xù)收集樣本資料，完善實驗結(jié)果。參考文獻(xiàn)1、王平, 彭芝蘭, 張家文, 等. 子宮頸癌新輔助化療中不同化療途徑的療效比較J. 中華婦產(chǎn)科雜志, 2005, 40(4): 227-230.2、王立峰，劉寶瑞.鉑類、紫杉類藥物個體化治療研究進(jìn)展J.癌癥進(jìn)展，2011，9（5）：533.3、沈曉燕, 崔恒. 復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性子宮頸癌化療的研究進(jìn)展J. 中華婦產(chǎn)科雜志, 2013, 48(010): 788-791.4、1.Leath III C A, Straughn Jr J M. Chem

20、otherapy for advanced and recurrent cervical carcinoma: results from cooperative group trialsJ. Gynecologic oncology, 2013, 129(1): 251-257.5、安云婷, 李隆玉, 鄧克華, 等. 紫杉醇聯(lián)合順鉑/卡鉑在宮頸癌新輔助化療中的作用J. 實用癌癥雜志, 2007, 21(5): 499-501.6、Kurtz J E, Freyer G, Joly F, et al. Combined Oral Topotecan plus Carboplatin in Rel

21、apsed or Advanced Cervical Cancer: A GINECO Phase I-II TrialJ. Anticancer research, 2012, 32(3): 1045-1049.7、沈連強(qiáng), 張國玲. 吉西他濱介入治療晚期和中晚期宮頸癌 58 例臨床觀察J. 蘇州大學(xué)學(xué)報 (醫(yī)學(xué)版), 2003, 6: 090.8、李學(xué)真, 鄒文, 李敏, 等. 多西他賽聯(lián)合卡鉑同步放化療門診治療中晚期宮頸癌的近期療效觀察J. 中國全科醫(yī)學(xué), 2012, 15(30): 3523-3525.9、肖軍霞. 多柔比星對人宮頸癌 Hela 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察J. 中華腫瘤防治雜志, 2009, 16(22): 1749-1752.10、陳歷排. 用微量板 ATP 生物發(fā)光法檢測腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性J. 腫瘤, 2000, 20(2): 103-105.11、Sevin BU, Peng ZL, Perras JP, Ganjei P, Penalver M,Averette HE. Application of an ATP -bioluminescence assay in h