“現(xiàn)代生物科技專題”模塊中若干問(wèn)題探討

1、 “現(xiàn)代生物科技專題”模塊中若干問(wèn)題探討江蘇省中小學(xué)教學(xué)研究室（210013）  吳舉宏1、限制性核酸內(nèi)切酶是如何命名的？怎樣理解其識(shí)別序列的特異性和切割位點(diǎn)的特異性？限制性核酸內(nèi)切酶的命名，目前主要以Smith和Nathans的命名系統(tǒng)為基礎(chǔ)，后多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的研究者在此基礎(chǔ)上對(duì)其作了補(bǔ)充規(guī)定。限制性核酸內(nèi)切酶命名的主要規(guī)則有：酶的基本名稱由寄主微生物屬名的第一個(gè)字母和種名的前兩個(gè)字母構(gòu)成，書寫時(shí)屬名的第一個(gè)字母為大寫、斜體，種名的前兩個(gè)字母為小寫、斜體。若該微生物有不同的變種或品系，再加上該變種或品系的第一個(gè)字母，書寫時(shí)該字母為小寫、正體。若某一種寄主菌株，具有幾個(gè)不同的限制-修

2、飾體系，則以正體羅馬數(shù)字表示。除了以上規(guī)定外，基本名稱前面一般還應(yīng)帶有系統(tǒng)名稱，限制性核酸內(nèi)切酶為“R”，甲基轉(zhuǎn)移酶為“M”，中間用“.”隔開(kāi)。若上下文含意十分清晰，系統(tǒng)名稱可省略。例如，“M.Hind”中“M”為甲基轉(zhuǎn)移酶的系統(tǒng)名稱，“Hin”為流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）的基本名稱，“d”為該菌品系的第一個(gè)字母，“”為該菌不同限制-修飾體系的序號(hào)。已經(jīng)鑒定出的限制性核酸內(nèi)切酶有4種不同類型：型酶、型酶、型酶和型酶，其中型酶為基因工程中最常用的工具酶，其余則很少或尚無(wú)應(yīng)用，因?yàn)橹挥行兔讣饶茏R(shí)別特定的核苷酸序列，又能在固定位置切割雙鏈DNA分子，所以我們通常所說(shuō)的

3、“限制性核酸內(nèi)切酶”其實(shí)就是指“型限制性核酸內(nèi)切酶”。型限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別堿基序列并非全部是嚴(yán)格的專一，如EcoR識(shí)別序列為5-GAATTC-3，而BstN識(shí)別序列為5-CCWGG-3（W為A或T），Mae識(shí)別序列為5-GTNAC-3（N為任意堿基），Hind可識(shí)別4種核苷酸序列即5-GTYRAC-3（Y為C或T，R為A或G）。大多數(shù)型限制性核酸內(nèi)切酶在識(shí)別序列處特異性切割雙鏈DNA分子，水解磷酸二酯鍵，產(chǎn)生3端羥基、5端磷酸基團(tuán)的DNA片段。其酶切位點(diǎn)一般在識(shí)別序列內(nèi)部，少數(shù)酶切位點(diǎn)在識(shí)別序列的兩側(cè)，如BamH的酶切位點(diǎn)是5-GGATCC-3，Mbo的酶切位點(diǎn)是5-GATC-3（“”處為酶

4、切位點(diǎn)，下同）。酶切后產(chǎn)生的片段末端有黏性末端和平末端等形式，若在識(shí)別序列雙側(cè)進(jìn)行切割，會(huì)產(chǎn)生5黏性末端或3黏性末端，若在識(shí)別序列的對(duì)稱軸上切割，則形成平末端。來(lái)源各異的不同種限制性核酸內(nèi)切酶也有可能識(shí)別序列相同、切割位點(diǎn)相同或產(chǎn)生相同黏性末端。若不同種限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列相同，但切割位點(diǎn)不同，它們互為新裂酶，如Aat、Zra識(shí)別序列相同，但切割位點(diǎn)分別為5-GACGTC-3、5-GACGTC-3。若不同種限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列和切割位點(diǎn)均相同，則稱為同切點(diǎn)酶（同裂酶），如Hpa、Msp識(shí)別序列和切割位點(diǎn)均為5-CCGG-3。若不同種限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列各不相同，但切割后能產(chǎn)生相同的

5、黏性末端，則稱為同尾酶，如BamH、Bcl、Bgl、Sau3A、Xho為一組同尾酶，它們的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)依次分別是5-GGATCC-3、5-TGATCA-3、5-AGATCT-3、5-GATC-3、5-RGATCY-3，它們切割DNA后都形成由GATC組成的黏性末端。由同尾酶酶切產(chǎn)生的DNA片段，能夠通過(guò)黏性末端的互補(bǔ)作用而彼此連接起來(lái)。2、引物都是DNA片段嗎？引物(primer)是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn)，它與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)，在生物體內(nèi)的DNA復(fù)制和人工擴(kuò)增DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制中，由于DNA聚

6、合酶只能把核苷酸連接到已經(jīng)形成的和DNA模板鏈互補(bǔ)的多核苷酸鏈上，而不能從頭開(kāi)始把核苷酸連接起來(lái)，這個(gè)先已存在的多核苷酸鏈就是引物。該引物不是DNA而是由10個(gè)左右核苷酸組成的RNA短鏈，它是通過(guò)引物酶（primase）的作用合成的。每合成一條DNA鏈，就需要一個(gè)引物，故在復(fù)制岡崎片斷時(shí)，每一片斷的前段都有一個(gè)RNA引物，復(fù)制完成后，RNA引物被修復(fù)系統(tǒng)移去。在利用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時(shí)，同樣由于DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，而只能從3端延伸DNA鏈，因此引物對(duì)（引物、引物）在PCR反應(yīng)體系的配方中是必須組成成分。用于PCR的引物，其本質(zhì)是單鏈的DNA片段，其設(shè)計(jì)要求主要有：長(zhǎng)度一般為1

7、630bp為宜（通常為2030個(gè)核苷酸人教版選修1），最佳為2024bp；G+C含量以4060%為佳；兩個(gè)引物之間不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)，以避免形成“引物二聚體”等。3、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法一般不能用于轉(zhuǎn)化單子葉植物嗎？利用農(nóng)桿菌對(duì)植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，首先將目的基因插入到Ti質(zhì)粒衍生的轉(zhuǎn)化載體上，形成重組DNA，然后將重組DNA轉(zhuǎn)入含有Vir致病基因的農(nóng)桿菌，再通過(guò)上述農(nóng)桿菌侵染植物外植體。植物傷口處的細(xì)胞分泌大量的酚類化合物、中性糖，酚類化合物如乙酰丁香酮（AS）和羥基乙酰丁香酮（HO-AS）等，一些中性糖如L-阿拉伯糖、D-木糖等，上述物質(zhì)既是根瘤農(nóng)桿菌的趨化物，又是農(nóng)桿菌中毒性基因Vir表達(dá)的誘導(dǎo)物，在它們的作

8、用下，導(dǎo)致T-DNA的加工和轉(zhuǎn)移，從而侵染植物細(xì)胞。研究表明，作為主要誘導(dǎo)物的乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酮等酚類物質(zhì)，主要在雙子葉植物細(xì)胞壁中合成，通常不存在于單子葉植物中，因此根瘤農(nóng)桿菌不易直接侵染單子葉植物。但是，后來(lái)經(jīng)過(guò)調(diào)整和改進(jìn)有關(guān)技術(shù)，如選擇合適的農(nóng)桿菌菌株、添加乙酰丁香酮等趨化和誘導(dǎo)物質(zhì)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法在水稻、小麥等單子葉植物中也獲得成功，從而使其成為一種被廣泛地應(yīng)用于單子葉植物和雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化的方法。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于簡(jiǎn)單有效、轉(zhuǎn)化的外源DNA結(jié)構(gòu)完整、整合位點(diǎn)穩(wěn)定、轉(zhuǎn)化效率高、整合后外源基因結(jié)構(gòu)變異小等，當(dāng)然單子葉植物的轉(zhuǎn)化率（也可達(dá)20%30%）還是比雙子葉植物的

9、轉(zhuǎn)化率（可高達(dá)80%90%）低。4、病毒作為載體是如何攜帶目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞？基因工程中的“分子運(yùn)輸車”除質(zhì)粒外，還有噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒等。教材對(duì)質(zhì)粒的分子結(jié)構(gòu)和工作原理進(jìn)行了詳細(xì)的描述，那么病毒是如何攜帶目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的呢？下面就以噬菌體為例，簡(jiǎn)要介紹其表達(dá)載體的構(gòu)建。迄今已經(jīng)定位的噬菌體的基因至少有61個(gè)，其中有一半左右參與了噬菌體生命周期的活動(dòng)，這些基因所在區(qū)段是噬菌體生長(zhǎng)繁殖所必需的，在表達(dá)載體構(gòu)建中為不可替代區(qū)；而另一部分基因?qū)τ谑删w生長(zhǎng)周期不是必需的，這些基因所在區(qū)域就稱為可替代區(qū)，如果用外源基因取代之后，并不影響噬菌體的生命功能，正是這一特點(diǎn)構(gòu)成了噬菌體作為外源

10、基因表達(dá)載體的基礎(chǔ)。野生型噬菌體DNA必須經(jīng)過(guò)改造才能成為理想的載體，其構(gòu)建過(guò)程主要有：刪除基因組中非必需區(qū)，建立外源DNA片段的替換點(diǎn)，增加承載外源DNA片段的容量。在非必需區(qū)內(nèi)插入或替換選擇的標(biāo)記基因和目的基因。建立重組DNA分子的體外包裝系統(tǒng)，使之有效地感染受體細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，將目的基因插入或替換進(jìn)入病毒基因組的可替代區(qū)，再利用病毒的侵染性，將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，這就是病毒作為“分子運(yùn)輸車”的基本機(jī)理。5、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否整合到受體細(xì)胞的核DNA中？目的基因被導(dǎo)入到受體細(xì)胞后的分布位置，主要與所選擇的運(yùn)載體和受體細(xì)胞等生理特性有關(guān)，目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，有的游離在細(xì)胞質(zhì)中

11、，有的被整合到染色體DNA中。目前經(jīng)常使用的載體，主要有質(zhì)粒和病毒兩類。攜帶目的基因的質(zhì)粒，它本身就是一種穩(wěn)定而獨(dú)立的重組DNA分子。因此重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞后，常不需要把所攜帶的基因轉(zhuǎn)到受體細(xì)胞的染色體上去，就會(huì)進(jìn)行自我復(fù)制，異源性DNA也得到了復(fù)制。另外，葉綠體和線粒體DNA等作為新型運(yùn)載體，攜帶目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，也是游離在細(xì)胞質(zhì)中。除了質(zhì)粒之外，噬菌體、動(dòng)植物病毒等也可以作為載體。利用病毒作為基因運(yùn)載體時(shí)，所攜帶的目的基因一般需要整合到受體細(xì)胞的染色體DNA中去，才能成為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)而獨(dú)立復(fù)制傳遞。例如噬菌體侵染細(xì)菌后，并不傷害受體細(xì)胞地和細(xì)菌擬核DNA整合到一起，隨著細(xì)菌擬核DNA

12、復(fù)制而復(fù)制；采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法而導(dǎo)入的外源基因，通常都是被整合到染色體DNA中，因此由此獲得的轉(zhuǎn)基因植物相關(guān)性狀呈孟德?tīng)柺竭z傳。在自然界中，SV40等致癌病毒侵染后形成的DNA就是整合到宿主細(xì)胞染色體DNA中進(jìn)行復(fù)制的；HIV侵入宿主細(xì)胞后經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄形成DNA，形成的DNA再拼接到宿主細(xì)胞的核DNA中。6、原核生物中的限制性內(nèi)切酶有何作用？它為什么不剪切自身DNA？作為“分子手術(shù)刀”的限制性核酸內(nèi)切酶主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的，迄今已從近300種不同微生物中分離出了約4000種限制酶。那么這些限制酶在原核生物體內(nèi)有什么作用？它什么不剪切自身的DNA呢？原核生物在自然界中很容易受

13、到外源DNA的入侵，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中就形成了一套完善的防御機(jī)制，以保持自身遺傳的相對(duì)穩(wěn)定性。限制酶就是一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入后，限制酶就將其切割掉，使外源DNA不能發(fā)揮遺傳效應(yīng)。在防御外源DNA入侵的同時(shí)，對(duì)自身DNA還具有一種保護(hù)機(jī)制。限制性內(nèi)切酶往往與一種甲基化酶同時(shí)成對(duì)存在，它們具有相同的底物專一性，具有識(shí)別相同堿基序列能力。甲基化酶的甲基供體為S-腺苷甲硫氨酸，甲基受體為DNA上的腺嘌呤與胞嘧啶。當(dāng)限制酶作用位點(diǎn)上的某一些堿基被甲基化修飾后，限制酶就不能再降解這種DNA了，所以限制性內(nèi)切酶只降解外源入侵的異種DNA，而不分解自身DNA，在消解外源DNA遺傳干擾的同時(shí)又保護(hù)了

14、自身遺傳特性的穩(wěn)定。7、植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基中為什么添加蔗糖而不是葡萄糖？在植物組織培養(yǎng)初期，由于植物組織或細(xì)胞不能進(jìn)行光合作用，因此需要供給碳源和能源。不少師生提出的疑問(wèn)有二：植物細(xì)胞能吸收蔗糖嗎？為什么不用葡萄糖作為碳源和能源？由于教材中質(zhì)壁分離和復(fù)原實(shí)驗(yàn)的影響，不少師生認(rèn)為，蔗糖不能被植物細(xì)胞吸收，其實(shí)蔗糖分子是可以進(jìn)入植物細(xì)胞的。植物組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中的蔗糖濃度較低，而質(zhì)壁分離實(shí)驗(yàn)中的蔗糖濃度很高，質(zhì)壁分離的時(shí)間短，細(xì)胞吸收蔗糖的量很少，在短時(shí)間內(nèi)不足以影響細(xì)胞液滲透壓，由此才出現(xiàn)壁分離現(xiàn)象。在蔗糖濃度較低時(shí)，蔗糖以被動(dòng)擴(kuò)散的形式進(jìn)入植物細(xì)胞，植物細(xì)胞內(nèi)有蔗糖轉(zhuǎn)化酶，在高等植物蔗糖代

15、謝中起著關(guān)鍵的作用。培養(yǎng)基中添加蔗糖而不是葡萄糖，是以大量實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的。大量實(shí)驗(yàn)表明，蔗糖能支持絕大多數(shù)植物離體培養(yǎng)物的旺盛生長(zhǎng)，因此被作為植物組織培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)碳源而廣泛應(yīng)用，大多數(shù)合成培養(yǎng)基也均以蔗糖作為唯一的碳源。其中的原因可能有下列幾個(gè)方面：同樣作為碳源和能源物質(zhì)，蔗糖較葡萄糖能更好地維持培養(yǎng)基內(nèi)的低滲環(huán)境。配制相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的培養(yǎng)基，蔗糖形成的滲透壓要明顯低于葡萄糖，若采用葡萄糖作為碳源，易使植物細(xì)胞脫水而生長(zhǎng)不良。同時(shí)，植物細(xì)胞吸收蔗糖的速率要明顯慢于吸收葡萄糖的速率，所以蔗糖形成的滲透壓可較長(zhǎng)時(shí)間地保持相對(duì)穩(wěn)定。植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，要特別注意防止培養(yǎng)基受到微生物的污染。微生物生長(zhǎng)所需的

16、碳源最適合的是葡萄糖，而較少利用蔗糖，因此采用蔗糖作為培養(yǎng)基的碳源，可在一定程度上減少微生物的污染。從能源供應(yīng)來(lái)說(shuō)，相同物質(zhì)的量濃度下，蔗糖比葡萄糖提供的能量多。當(dāng)然，不同植物對(duì)不同糖類的反應(yīng)是不完全相同的。近年來(lái)不斷有研究報(bào)道，在西黃松(Pinus ponderosa)下胚軸離體培養(yǎng)中葡萄糖和蔗糖對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)及保持具有相同效果(Tuskan等，1990)，在白長(zhǎng)春花(Catharanthus roseus)離體培養(yǎng)中，葡萄糖有較高的生物產(chǎn)量，但生物堿產(chǎn)量與使用蔗糖時(shí)相似(Flower等，1982)，在小麥花藥培養(yǎng)中供應(yīng)9%葡萄糖優(yōu)于蔗糖(朱至清，1991)，等等。8、單克隆抗體制備過(guò)程中

17、，如何篩選雜交瘤細(xì)胞？在單克隆抗體的制備過(guò)程中，篩選產(chǎn)生單一抗體的特異性雜交瘤細(xì)胞是本技術(shù)的關(guān)鍵步驟。在細(xì)胞混合物中含有骨髓瘤細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞的融合細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞，通常采用HAT培養(yǎng)液進(jìn)行篩選培養(yǎng)，由于B淋巴細(xì)胞不能在體外天然增殖，因而未融合的B淋巴細(xì)胞以及B淋巴細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞的融合細(xì)胞不能在HAT培養(yǎng)液中培養(yǎng)。骨髓瘤細(xì)胞是次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型（HGPRT）細(xì)胞，因而未融合的骨髓瘤細(xì)胞以及骨髓瘤細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞在HAT培養(yǎng)液中不能利用次黃嘌呤作為前體合成鳥嘌呤和腺嘌呤，同時(shí)在

18、HAT培養(yǎng)液中加入的氨基蝶呤阻斷了利用脫氫葉酸還原酶合成嘌呤的第2條代謝途徑，于是它們也不能增殖生長(zhǎng)。只有骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞可以在HAT培養(yǎng)液中增殖生長(zhǎng)，因?yàn)殡s交瘤細(xì)胞從B淋巴細(xì)胞處獲取了HGPRT，可以利用培養(yǎng)液中的外源次黃嘌呤，而培養(yǎng)液中添加的胸腺嘧啶可以克服由于氨基蝶呤抑制脫氫葉酸還原酶而阻礙的嘧啶合成。這樣，在細(xì)胞融合大約1014d之后，HAT培養(yǎng)液中只有骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞能夠增殖生長(zhǎng)。由于不同效應(yīng)B細(xì)胞的特異性存在差異，經(jīng)HAT培養(yǎng)液第一次篩選出的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體可能不同，還必須對(duì)雜交瘤細(xì)胞群進(jìn)行二次篩選，才可能篩選出產(chǎn)生特定抗體的

19、雜交瘤細(xì)胞。二次篩選通常采用有限稀釋克隆細(xì)胞的方法，將雜交瘤細(xì)胞多倍稀釋，接種到多孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，使培養(yǎng)板的每孔中只有一個(gè)細(xì)胞，通過(guò)培養(yǎng)使細(xì)胞增殖，然后可用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)每孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體類型。上清液中能與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔即為陽(yáng)性孔，陽(yáng)性孔中的細(xì)胞還不能保證是來(lái)自單個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋，一般重復(fù)3、4次，直至確定每孔中細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。9、精子為何能群體同步成熟？青春期卵原細(xì)胞的產(chǎn)生最旺盛嗎？減數(shù)分裂發(fā)生的時(shí)期和受精作用發(fā)生的標(biāo)志是什么？當(dāng)原生殖細(xì)胞（primordial germ cell）到達(dá)發(fā)育中的生殖腺后，分裂形成精原細(xì)胞，并且不斷增殖。而精原細(xì)胞增殖以及以后的

20、減數(shù)分裂的兩次細(xì)胞分裂，細(xì)胞質(zhì)分裂是不完全的。多個(gè)細(xì)胞形成合胞體，細(xì)胞之間通過(guò)直徑1m的細(xì)胞質(zhì)橋進(jìn)行溝通，細(xì)胞間的離子和分子通過(guò)相互交流而相互影響，從而保證了每群細(xì)胞的同步成熟。從最初的精原細(xì)胞到精細(xì)胞的分裂過(guò)程中，細(xì)胞不斷遠(yuǎn)離生精小管的基膜，接近生精小管的管腔。精細(xì)胞位于管腔的邊緣，失去相互之間的細(xì)胞質(zhì)橋連接，而進(jìn)一步分化成精子。研究發(fā)現(xiàn)，人類女性卵巢內(nèi)細(xì)胞減數(shù)分裂在胚胎階段就已經(jīng)開(kāi)始，在減數(shù)第一次分裂前期初級(jí)卵母細(xì)胞不斷發(fā)育，但是被阻斷在雙線期。從12歲左右開(kāi)始，極少數(shù)的初級(jí)卵細(xì)胞獲得恢復(fù)減數(shù)分裂的信號(hào)物質(zhì)，繼續(xù)進(jìn)行減數(shù)分裂的過(guò)程，而大多數(shù)初級(jí)卵母細(xì)胞不斷死亡，有的甚至被阻斷于減數(shù)第一次分裂前期長(zhǎng)達(dá)50年之久。卵細(xì)胞具有十分復(fù)雜的細(xì)胞質(zhì)體系，卵細(xì)胞含