植物MS組培實(shí)驗(yàn)use

1、實(shí)驗(yàn)一、MS液體成份的配制一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、掌握植物組織培養(yǎng)常用MS液體培養(yǎng)基成份的配制；2、為后續(xù)組培實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備工作。二、實(shí)驗(yàn)基本原理MS培養(yǎng)基是Murashige和Skoog（二人縮寫）于1962年為煙草細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)的，其特點(diǎn)是無機(jī)鹽和離子濃度較高，其養(yǎng)分的數(shù)量和比例合適，是較穩(wěn)定的離子平衡溶液，能滿足植物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和生理需要，適用范圍比較廣，多數(shù)植物組織培養(yǎng)快速繁殖用它作為培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基。 三、實(shí)驗(yàn)儀器與與試劑1、實(shí)驗(yàn)儀器： 1000ml/500ml量筒4個(gè)、250ml三角瓶（每人2個(gè)）、1000ml燒杯或塑料量杯5個(gè)、1000ml試劑瓶5個(gè)、10只100mL試劑瓶、微波爐、10m

2、l離心管15個(gè)、玻璃棒5個(gè)、電子天平、稱量紙、卷紙、移液槍（1000µL、100µL）、藥勺。2、實(shí)驗(yàn)試劑： 見下述實(shí)驗(yàn)方案中所列。四、實(shí)驗(yàn)方案與操作1、大量元素20X母液配制（貯備液I）配制20X（倍）濃度大量元素母液1000mL，按順序充分溶解后再加后一個(gè)試劑。 KNO31900 mg/L（1.9g/L）NH4NO31650 mg/L（1.65g/L） KH2PO4 170 mg/L（0.17g/L） MgSO4. 7H2O 370 mg/L（0.37g/L）CaCl2. 2H2O 440 mg/L（0.44g/L）（可單獨(dú)瓶配制存放）2、微量元素100X母液（貯備液I

3、I）配制：配制100X（倍）濃度大量元素母液1000mL，按順序充分溶解后再加后一個(gè)試劑。 KI 0.83 mg/L（先配母液：0.83 g KI溶于8 mL水） H3BO3 6.2 mg/L（先配母液：0.62 g溶于8 mL水） MnSO4 .4H2O 22.3 mg/L（先配母液：0.22 g溶于8 mL水） ZnSO4 .7H2O 8.6 mg/L（先配母液：0.86 g溶于8 mL水） Na2MoO4 .2H2O 0.25 mg/L（先配母液：0.25 g溶于8 mL水） CuSO4 .5H2O 0.025 mg/L（先配母液：0.25 g溶于8 mL水） CoCl2 .6H2O 0

4、.025 mg/L（先配母液：0.25 g溶于8 mL水）3、鐵鹽100X母液（貯備液III） 配制100X（倍）濃度大量元素母液1000mL，按順序充分溶解后再加后一個(gè)試劑。 Na2 EDTA .2H2O 37.3 mg/L FeSO4 .7H2O 27.8 mg/L4、有機(jī)成分100X母液（貯備液IV） 配制100X（倍）濃度大量元素母液1000mL，按順序充分溶解后再加后一個(gè)試劑。 肌醇 100 mg/L 甘氨酸 2 mg/L （先配母液：0.2 g溶于8 mL水） 鹽酸硫胺素(VB1)0.1 mg/L（先配母液：0.02 g溶于8 mL水） 鹽酸吡哆醇(VB6)0.5 mg/L（先配母

5、液：0.05 g溶于8 mL水） 煙酸(VB5)0.5 mg/L（先配母液：0.02 g溶于8 mL水）5、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配制： 6-BA(1mg/mL）：稱10mg 6-BA先溶于1mL 1M鹽酸充分溶解，再加9mL以蒸餾水，混勻。 NAA(1mg/mL）：稱10mg NAA先溶于1mL 95%乙醇充分溶解，再加9mL以蒸餾水，混勻。五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1、配制貯存母液時(shí)，要算好各種成分逐次加入，等第一種成分完全溶解后再加入第二種成分，切忌“一鍋煮”。有機(jī)物質(zhì)配好以后要裝入棕色瓶放入電冰箱內(nèi)保存，其它三種母液可在常溫下保存但最多不能超過一個(gè)月；2、pH值對(duì)培養(yǎng)基的硬度有影響，pH過高培養(yǎng)基變硬

6、，pH過低培養(yǎng)基不能凝固，所以要調(diào)整好培養(yǎng)基的pH值；六、作業(yè)：認(rèn)真總結(jié)，完成本實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)二、MS固體培養(yǎng)基的配制與滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握植物組織培養(yǎng)常用MS固體培養(yǎng)基的配制和滅菌方法；2、為下次組培實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備工作。二、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑1、實(shí)驗(yàn)儀器高壓滅菌鍋、微波爐、100-200個(gè)組培瓶、pH試紙、4個(gè)1000mL量筒、4個(gè)1000mL塑料量杯、4只玻璃棒、移液槍（1000µL、100µL）、稱量紙、卷紙、電子天平、藥勺2、實(shí)驗(yàn)試劑：10NaOH、1M HCl、蔗糖，瓊脂三、實(shí)驗(yàn)操作步驟1、在1000mL塑料量杯中，先加入800mL雙蒸水，再按比例依次加入下列MS成

7、份：大量元素20X母液：微量元素100X母液、鐵鹽100X母液、有機(jī)成份100X母液 50mL 10mL 10mL 10mL最后再用約雙蒸水（約120mL）定容到1000mL，充分混勻。靜置30min，觀察無沉淀方可用。2、稱取并繼續(xù)加入蔗糖30g，瓊脂粉7.5g，混勻。3、用10NaOH調(diào)節(jié)pH至5.8（用pH試紙或pH計(jì)測(cè)試），混勻。4、在微波爐中加熱至溶液均一、穩(wěn)定（要補(bǔ)充蒸發(fā)的水）。5、將配好的MS培養(yǎng)基趁熱迅速分裝至三角瓶或廣口組培瓶中，每瓶?jī)A倒30ml即可，蓋上瓶蓋（蓋要松點(diǎn)），裝入滅菌筐。6、放入高壓滅菌鍋121，滅菌20min（整個(gè)過程約1h左右）。7、滅菌結(jié)束后，立即拿出瓶子

8、，趁熱擰緊每個(gè)瓶蓋。8、置于組培室架子上觀察3-7天，無菌落長(zhǎng)出說明良好，供下步組培用。四、作業(yè)：認(rèn)真總結(jié)，完成本實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)三、外植體的消毒、接種與培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆胀庵搀w材料化學(xué)消毒和在固體培養(yǎng)基上接種的方法。 二、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑1、實(shí)驗(yàn)材料：新鮮胡蘿卜2、實(shí)驗(yàn)儀器超凈工作臺(tái)、酒精燈、三角瓶、培養(yǎng)皿、鑷子、刀片、剪刀、燒杯、滅菌濾紙、紗布3、實(shí)驗(yàn)試劑配制好的MS固體培養(yǎng)基、10%次氯酸鈉、無菌水、酒精、NAA，6-BA，NaOH三、實(shí)驗(yàn)操作方法（一）外植體的消毒1、準(zhǔn)備工作：提前40min打開超凈工作臺(tái)紫外燈殺菌20min，關(guān)閉后再打開風(fēng)機(jī)吹20min。坐到超凈臺(tái)前，將裝有經(jīng)濕熱滅菌M

9、S固體培養(yǎng)基的三角瓶、配好的消毒液、洗凈瀝干的植物材料置于超凈工作臺(tái)上，用70%酒精棉球擦手與器具外壁。2、外植體的消毒：選取胡蘿卜的韌皮部，用水洗凈。先用70酒精浸泡15-30s，然后放入6的次氯酸鈉溶液浸泡20min，進(jìn)行材料脫毒，然后用無菌水沖洗5次。（二）外植體的切片與接種用刀片切取紅色韌皮部（不含中央黃色部位）成1cm2大小方塊，厚度約0.2 cm。將消毒好的胡蘿卜韌皮部切片，在超凈工作臺(tái)上用鑷子接種于已滅菌的含MS固體培養(yǎng)基的三角瓶中，封口。注意規(guī)范操作，防止污染。（三）外植體的初步培養(yǎng)將接種后的培養(yǎng)基三角瓶置于組培室光照培養(yǎng)架上，先弱光培養(yǎng)1周，再1000-2000lux光照培養(yǎng)

10、數(shù)周，光周期為每天光照1416h /黑暗 810h。期間經(jīng)常來觀察，及時(shí)清除有污染者和觀察外植體的變化。四、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1、實(shí)驗(yàn)所使用的器材要嚴(yán)格滅菌，注意無菌操作，避免因染菌導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失??；2、材料脫毒時(shí)不要在酒精中停留過長(zhǎng)時(shí)間，以免材料被殺死；3、接種后進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，為確保實(shí)驗(yàn)成功，可以首先進(jìn)行7-10d的暗培養(yǎng)，然后再進(jìn)行光照培養(yǎng)。五、作業(yè)：認(rèn)真總結(jié)，完成本實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)四、胡蘿卜韌皮部的繼代培養(yǎng)培養(yǎng)與觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)并掌握外植體在固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)方法和不同階段的培養(yǎng)方案與技術(shù)區(qū)別。 二、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑1、實(shí)驗(yàn)材料：前期培養(yǎng)的外植體2、實(shí)驗(yàn)器具超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、酒精燈、三角瓶、

11、培養(yǎng)皿、鑷子、刀片、剪刀、燒杯、滅菌濾紙、紗布3、培養(yǎng)基方案分化培養(yǎng)基：基本MS培養(yǎng)基（含30 g/L蔗糖、7.2 g/L瓊脂，pH5.8）3mg/L 2,4-D + 1mg/L KT +300mg/L Cef。生根培養(yǎng)基：1/2MS（含28 g/L蔗糖、7g/L瓊脂，pH5.8）+ 1mg/L 2,4-D +200mg/L Cef。三、實(shí)驗(yàn)操作方法1、外植體的繼代與愈傷組織培養(yǎng)將暗培養(yǎng)1周后的胡蘿卜外植體在無菌條件下轉(zhuǎn)移到含500mg/L Cef的抑菌與愈傷培養(yǎng)基上，在26光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，以促進(jìn)愈傷細(xì)胞的增殖。2、分化培養(yǎng)將愈傷培養(yǎng)后的胡蘿卜外植體在無菌操作下轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上，在組培室

12、中(25，光照，RH7585%)進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以誘導(dǎo)不定芽或胚狀體的發(fā)生。光周期為每天光照1416h /黑暗 810h，繼代培養(yǎng)周期為816天(取決于有無污染情況)，這是一個(gè)漫長(zhǎng)且極其重要的過程，約需5-8周。每2天觀察統(tǒng)計(jì)有無污染、不定芽發(fā)生數(shù)量及生長(zhǎng)情況，并及時(shí)拍照。對(duì)于有污染的外植體應(yīng)及時(shí)消毒處理并隔離培養(yǎng)觀察或者清除。3、芽苗的生根培養(yǎng)當(dāng)分化培養(yǎng)中產(chǎn)生的芽苗生長(zhǎng)到2-3cm時(shí)，用手術(shù)刀切下插入到1/2MS生根培養(yǎng)基淺層，在組培室中繼續(xù)進(jìn)行繼代培養(yǎng)(適當(dāng)增加光照強(qiáng)度和光照時(shí)間），約在24周內(nèi)可生長(zhǎng)出大量白色的毛發(fā)狀根。應(yīng)經(jīng)常觀察拍照。4、污染率、成苗率的統(tǒng)計(jì)污染率污染的外植體個(gè)數(shù)/接種時(shí)

13、外植體總個(gè)數(shù) ×100%成苗率不定芽分化成小苗的個(gè)數(shù)/接種時(shí)外植體總個(gè)數(shù) ×100%五、作業(yè)：認(rèn)真總結(jié)，完成本實(shí)驗(yàn)報(bào)告，將培養(yǎng)結(jié)果照片附在報(bào)告中。實(shí)驗(yàn)五 PEG介導(dǎo)的細(xì)胞融合一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、理解PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合的原理，掌握實(shí)驗(yàn)方法與技能。2、了解影響細(xì)胞PEG介導(dǎo)融合的因素。二、實(shí)驗(yàn)原理2個(gè)或以上的細(xì)胞合并為1個(gè)細(xì)胞的現(xiàn)象，稱為細(xì)胞融合。細(xì)胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇（PEG）法和電融合方法。PEG是乙二醇的多聚化合物，一般常用分子質(zhì)量為MW 40006000的50%PEG溶液，首先引起細(xì)胞的集聚與粘連，然后改變各類細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處脂分子雙層發(fā)生疏松和

14、重排，由于兩細(xì)胞接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親合以及彼此的表面張力作用，使細(xì)胞發(fā)生融合，胞質(zhì)流通，最后形成融合細(xì)胞。細(xì)胞融合頻率和活力與所用PEG的分子質(zhì)量、濃度、作用時(shí)間、細(xì)胞的生理狀態(tài)與密度等有關(guān)。三、實(shí)驗(yàn)器材1、材料：新鮮雞血紅細(xì)胞2、器具：光學(xué)顯微鏡，離心機(jī)，恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水浴鍋，電磁爐、離心管、燒杯、容量瓶、木夾子、載玻片，蓋玻片等。3、試劑與配制：10.85 % NaCl 溶液 2GKN液：8.0g NaCl，0.4g KCl，3.56 g Na2HPO4·12H2O，0.78 g NaH2PO4·2H2O，2.0g葡萄糖，0.01g酚紅，溶于1000ml重蒸水中

15、。 333%（W/V）PEG溶液 1. 取10g PEG（分子質(zhì)量=4000）放入50ml 瓶中，在電磁爐水浴鍋中加熱熔化后，再邊攪拌繼續(xù)加熱6min。 2. 讓PEG冷卻至50，勿讓其凝固。 3. 邊攪拌邊加入15ml預(yù)熱至50的GKN液，再充分混勻，置37水浴鍋中待用。 4肝素鈉：100ml 0.85%生理鹽水中溶解0.04g肝素鈉（125U/mg），加入40ml全血?？上扰?00倍母液：用0.85%生理氯化鈉鹽水配成1%肝素溶液（200mg /10ml）。再稀釋：按1：40，用0.85%氯化鈉溶液將母液稀釋好，再采雞血。四、實(shí)驗(yàn)方法1. 雞血的獲得： 從在燒杯中事先加入配好的肝素鈉（10

16、0U 肝素/ 5ml全血），到菜市場(chǎng)采集雞血，按1：4體積比制成抗凝全血，置于4冰箱內(nèi)可供一周內(nèi)使用。 2. 雞血紅細(xì)胞懸液的制備： （1）取雞血儲(chǔ)備液1 ml，加入4ml（4倍體積）0.85 %NaCl溶液，上下顛倒輕柔充分混勻后，1500rpm離心5min，輕輕棄去上清液留沉淀。（2）加入4ml 0.85% NaCl溶液, 混勻，1500rpm離心5min，輕輕棄去上清液留沉淀。（3）給沉淀中再加入4ml 0.85% NaCl溶液, 混勻，1500rpm離心4min，輕輕棄去上清液留沉淀。（4）給沉淀中再加入4ml GKN溶液, 混勻，1500rpm離心4min，輕輕棄去上清液留沉淀。（5）細(xì)胞沉淀中再加入2 ml GKN稀釋充分混勻使細(xì)胞懸浮，37溫浴靜置5min。 3. 33%PEG溶液的制備:稱取10克PEG(MW=4,000)放入燒杯內(nèi)，在微波爐上融化之，冷卻至50, 加入2倍體積(15ml)預(yù)熱至50的GKN液，迅速混勻，制成33 PEG溶液，放入37水浴中待用。4. PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合： （5）吸取0.5 ml純化后的雞血，沿著離心管壁逐滴加入1.0 ml 33%PEG溶液，邊加邊輕搖離心管，加完后輕彈使PEG與細(xì)胞充分混勻；（6）然后在37水浴中靜置15-20min；期間洗好載玻、蓋玻片，待鏡檢。（7）再給管中加入2 ml