SSR分子標(biāo)記技術(shù)及其在構(gòu)建玉米DNA指紋庫(kù)上的應(yīng)用(一)

1、SSR分子標(biāo)記技術(shù)及其在構(gòu)建玉米DNA 指紋庫(kù)上的應(yīng)用 (一)摘要 SSR分子標(biāo)記技術(shù)是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種DNA 多態(tài)性檢測(cè)技術(shù) ,已廣泛應(yīng)用于植物基因組研究的各個(gè)領(lǐng)域。概述了SSR標(biāo)記的原理、類型、功能及其引物的來(lái)源,利用 SSR構(gòu)建玉米 DNA 指紋庫(kù)的進(jìn)展,玉米 DNA 指紋庫(kù)在品種鑒定、品種保護(hù)及品種監(jiān)測(cè)等方面的應(yīng)用等,以為玉米品種的研究提供參考。關(guān)鍵詞SSR分子標(biāo)記;玉米;DNA指紋庫(kù);應(yīng)用AbstractSimplesequencerepeat(SSR)markersonthebasisofPCRasatechnologyofdetectionDNApolymorphis

2、mhavebeenwidelyusedinthestudiesofplantgenomeresearchinsomefields.Inthepaper,thetheories,types,functionsandsourcesofprimersbySSRmarkerwereclarified.ThentheprocessesofmaizeDNAfingerprintingpoolconstructionbySSRwereelaborated.FinallytheapplicationofmaizeDNAfingerprintingpooloncultivaridentification,cul

3、tivarprotection,cultivardetectionetalwaspointedtotakereferencesformaizevarietiesresearch.KeywordsSSRmolecularmarker;maize;DNAfingerprintingdatabase;application玉米是一種重要的飼用、糧用和工業(yè)加工作物,在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要的地位。玉米育種方法的改進(jìn)對(duì)農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要意義。長(zhǎng)期以來(lái),育種家們大多數(shù)是借助易于鑒別的形態(tài)學(xué)和同工酶等遺傳標(biāo)記來(lái)輔助育種,并取得了很大成功。但這類標(biāo)記的最大不足之處在于其數(shù)量有限,要找到與目標(biāo)性狀密切相關(guān)的標(biāo)記往往很

4、困難,難以應(yīng)用于育種實(shí)踐。因此 ,育種家們一直希望能夠找到一類數(shù)量豐富、選擇效應(yīng)高的標(biāo)記,以提高育種效率和育種過(guò)程的預(yù)見(jiàn)性。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,開(kāi)發(fā)了基于 DNA 變異的分子標(biāo)記。應(yīng)用最廣泛的主要有RFLP、RAPD、SSR、AFLP等 1,其中 SSR標(biāo)記是一種共顯性標(biāo)記 ,重復(fù)性好 ,可靠性高 ,分析簡(jiǎn)便,易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化 ,而且靈敏度高 ,檢測(cè)遺傳變異的能力強(qiáng) 2-4。近年來(lái),SSR標(biāo)記在玉米育種中得到了廣泛的應(yīng)用。1SSR標(biāo)記1.1SSR標(biāo)記的原理簡(jiǎn) 單 重 復(fù) 序 列 (Simplesequencerepeat,SSR),又 稱 為 微 衛(wèi) 星DNA(MicrosatelliteDN

5、A)。微衛(wèi)星通常是指以 24 個(gè)核苷酸為單位多次串聯(lián)重復(fù)的 DNA序列 ,也有少數(shù)以 16 個(gè)核苷酸為串聯(lián)重復(fù)單位。 微衛(wèi)星在基因組中的分布是隨機(jī)的,它可以存在于內(nèi)含子、外顯子及染色體的其他任何區(qū)域。在不同植物中,微衛(wèi)星重復(fù)單位的堿基組成及拷貝數(shù)隨物種的不同而有所差異 ,但人們發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星兩端的序列是保守的。因此 ,可以設(shè)計(jì)出與微衛(wèi)星兩端保守序列互補(bǔ)的引物,通過(guò) PCR擴(kuò)增重復(fù)序列本身并通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)其多態(tài)性。SSR序列多態(tài)性的出現(xiàn)是由于同一物種中不同基因型的寡核苷酸重復(fù)次數(shù)不同以及重復(fù)序列在染色體復(fù)制時(shí)的滑動(dòng)或染色單體的不等交換造成的。因此 ,微衛(wèi)星可用作分子標(biāo)記。由于玉米中存在轉(zhuǎn)座子 ,微

6、衛(wèi)星的多態(tài)性表現(xiàn)得極為豐富 ,所以 ,通過(guò)特異性引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增反應(yīng)、瓊脂糖凝膠電泳 (或聚丙烯酰胺凝膠電泳)、放射自顯影 (或銀染 )和 GeneScan技術(shù)等 ,就可以檢測(cè)到在簡(jiǎn)單重復(fù)序列重復(fù)單位數(shù)不同的DNA 區(qū)域的多態(tài)性 ,這也是 SSR技術(shù)較其他幾種分子標(biāo)記技術(shù)更適合于玉米研究的原因之一。SSR技術(shù)推動(dòng)了玉米研究的發(fā)展。1.2SSR標(biāo)記的類型按照重復(fù)單位的堿基數(shù)可將微衛(wèi)星分為一至六核苷酸重復(fù)類型,其中二核苷 酸重復(fù)有4 種類型 :(AT)n/(TA)n、 (AG)n/(TC)n、 (AC)n/(GT)n、(GC)n/(CG)n;三核苷酸重復(fù)有10 種類型 :(AAT)n/(TAT

7、)n、(AAG)n/(TCT)n、(AAC)n/(TGT)n、 (ATG)n/(TCA)n、 (AGT)n/(TAC)n、 (AGG)n/(TCC)n、(AGC)n/(TGC)n、(ACG)n/(TCG)n、(ACC)n/(TGG)n、(GGC)n/(CGC)n;四核苷酸重復(fù)類型有 32 種(Jurke,1995)。所有類型的微衛(wèi)星中以單核苷酸重復(fù)和二核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星在基因組中出現(xiàn)的頻率最高。同一重復(fù)類型中不同的堿基重復(fù)多態(tài)性也不一致。另外 ,Weber(1990)按照微衛(wèi)星核心序列結(jié)構(gòu)的不同將微衛(wèi)星標(biāo)記分為3種類型 : 完全型 (perfect),指核心序列以不間斷的重復(fù)方式構(gòu)成的微衛(wèi)星;

8、 不完全型 (imperfect), 指在微衛(wèi)星的核心序列之間有幾個(gè)非重復(fù)堿基 , 但其兩端的連續(xù)重復(fù)的核心序列重復(fù)次數(shù)大于3; 復(fù)合型(compound),指 2 種或 2 種以上的串聯(lián)核心序列由幾個(gè)連續(xù)的非重復(fù)堿基分隔開(kāi) ,但各種連續(xù)性的核心序列重復(fù)次數(shù)不少于5 若少于 5 次,則不能稱之為復(fù)合型。1.3SSR的功能SSR在真核生物基因組中的功能一直存在爭(zhēng)議。在植物基因組中,大多數(shù)串聯(lián)重復(fù)序列是非編碼的,所以長(zhǎng)期以來(lái)人們一直認(rèn)為SSR 是一類“垃圾 ” DNA,是轉(zhuǎn)錄啞區(qū) ,沒(méi)有明確的生理功能。隨著研究的深入,有關(guān)SSR功能的資料在不斷積累。 總的來(lái)說(shuō) ,SSR的功能主要有以下幾個(gè)方面:有些 SSR(通常為 47個(gè)堿基重復(fù)型 )存在于結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄區(qū),并且編碼氨基酸 ;染色體末端的 SSR有保護(hù) DNA完整性 ,避免降解、融合及丟失的功能 ;位于DNA 調(diào)控區(qū)的SSR有提高或降低臨近基因轉(zhuǎn)錄速率的作用;SSR區(qū)可能是基因重組的熱