生物界與生物學(xué)課件：23m

1、第四篇第四篇 遺傳與變異遺傳與變異23 重組重組DNA技術(shù)技術(shù)23 重組DNA技術(shù)l重組DNA技術(shù)，也稱基因工程或遺傳工程。l基因工程是指將特定的基因（即外源基因），通過載體或其它手段送入受體細(xì)胞，使它們在受體細(xì)胞中與受體細(xì)胞的基因進(jìn)行重組，并能增殖、表達(dá)，這樣一種遺傳學(xué)操作。l基因工程的目的:通過與優(yōu)良性狀相關(guān)的基因的重組，獲得具有高度應(yīng)用價(jià)值的新物種或新產(chǎn)品。23 重組DNA技術(shù)l基因工程的優(yōu)點(diǎn)基因工程的優(yōu)點(diǎn)克服物種間的屏障；有目的、有計(jì)劃、有選擇地加工制造各種生物制品；遺傳育種、醫(yī)學(xué)等研究和開發(fā)。23 重組DNA技術(shù)重組重組DNA技術(shù)技術(shù)23 重組DNA技術(shù)l 23.1 基因工程的相關(guān)技

2、術(shù)基因工程的相關(guān)技術(shù)l 23.1.1 核酸的分子雜交核酸的分子雜交l 1. DNA的變性與復(fù)性的變性與復(fù)性l DNA變性變性較高溫度解鏈成單鏈。l DNA復(fù)性復(fù)性變性的DNA逐漸冷卻，分離的兩條單鏈雙鏈的DNA。短鏈容易精確復(fù)性；長鏈復(fù)性較難。l 雜交分子雜交分子堿基序列大部分互補(bǔ)，可以復(fù)性。DNA與RNA之間，也一樣。23 重組DNA技術(shù)l2. 分子探針尋找特定基因分子探針尋找特定基因l3. Southern印跡印跡 可以檢測特定的DNA序列。l4. Northern印跡印跡 可以檢測特定基因的表達(dá)情況。l5. 原位雜交原位雜交 可以檢測特定細(xì)胞中某一基因的表達(dá)情況。23 重組DNA技術(shù)So

3、uthern印跡印跡23 重組DNA技術(shù)KNAT1的表達(dá)的表達(dá)23 重組DNA技術(shù)23 重組DNA技術(shù)l23.1.2 PCRl1. PCR技術(shù)的基本原理技術(shù)的基本原理l PCR反應(yīng)過程： 雙鏈DNA變性（9095）成為單鏈DNA；引物復(fù)性（37-60）同單鏈DNA互補(bǔ)序列結(jié)合； DNA聚合酶催化（70 75）使引物延伸。23 重組DNA技術(shù)PCR原理原理23 重組DNA技術(shù)l2. Taq DNA聚合酶聚合酶l3. 寡核苷酸引物寡核苷酸引物l4. PCR技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用23 重組DNA技術(shù)23 重組DNA技術(shù)l 23. 2 工具酶工具酶l 23.2.1 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶l （1）限制

4、性內(nèi)切酶的作用）限制性內(nèi)切酶的作用識(shí)別DNA中特定核苷酸序列，使每條鏈的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開。l （2）限制性內(nèi)切酶的類型）限制性內(nèi)切酶的類型I型、II型和III型。 II型酶基因工程。l （3）限制性內(nèi)切酶的命名限制性內(nèi)切酶的命名根據(jù)來源命名。如EcoR I 大腸桿菌（E. coli）、R株系、第一種。23 重組DNA技術(shù)l（4）限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列）限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列 能識(shí)別的特定核苷酸序列。46個(gè)堿基對組成，且堿基互補(bǔ)對稱。只寫單鏈的核苷酸序列。l（5）限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)）限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)II型酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序列區(qū)內(nèi)。23 重組DNA技術(shù)l6）切割片段的末端）切割片段的末

5、端lA.粘性末端粘性末端兩條鏈末端交錯(cuò)對稱。 5粘性末端 3粘性末端l B.平頭末端平頭末端 兩條鏈末端平齊。23 重組DNA技術(shù)粘性末端粘性末端23 重組DNA技術(shù)l 23.2.2 DNA連接酶及其連接作用連接酶及其連接作用催化-PO4和-OH形成磷酸二酯鍵。l （1）E. Coli DNA連接酶連接酶大腸桿菌（E. Coli）基因組編碼；連接具互補(bǔ)粘性末端的DNA片段。l （2）T4 DNA連接酶連接酶T4噬菌體DNA編碼；既連接具互補(bǔ)粘性末端的DNA片段，也能連接平頭末端。23 重組DNA技術(shù)l23.2.3 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶l從反轉(zhuǎn)錄病毒中制備得到的。l該酶能以具有3-OH 的DNA或R

6、NA為引物，以mRNA為模板從53聚合生成cDNA 。 23 重組DNA技術(shù)l23.3 基因基因(克隆克隆)的質(zhì)粒載體的質(zhì)粒載體l 基因載體基因載體運(yùn)送外源DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞。三個(gè)條件：有插入位點(diǎn)； 能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制； 有篩選標(biāo)記基因。23 重組DNA技術(shù)l23.3.1 質(zhì)粒質(zhì)粒l A.存在于細(xì)菌；藍(lán)藻、綠藻、真菌。l B.染色體外裸露環(huán)狀雙鏈DNA分子，小的不足1500bp，大的100kb以上。l C.宿主細(xì)胞內(nèi)能自主復(fù)制。松弛型和嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)粒。選用分子小和松弛型復(fù)制的質(zhì)粒。23 重組DNA技術(shù)l23.3.2 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體pBR322lA.有復(fù)制起始點(diǎn)，能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制；lB.

7、有2種篩選標(biāo)記基因；lC.有允許外源DNA插入的位點(diǎn)；lD.有高的拷貝數(shù)。23 重組DNA技術(shù)pBR322圖譜23 重組DNA技術(shù)l23.4重組重組DNA的基本步驟的基本步驟l23.4.1 獲得目的基因獲得目的基因l1. 構(gòu)建構(gòu)建cDNA文庫和基因組文庫分離目的基文庫和基因組文庫分離目的基因因l2. 用用PCR技術(shù)從基因組中擴(kuò)增出目的基因技術(shù)從基因組中擴(kuò)增出目的基因l3.人工合成人工合成DNA23 重組DNA技術(shù)l23.4.2 DNA分子的體外重組分子的體外重組l酶切和連接。23 重組DNA技術(shù)l23.4.3 重組重組DNA分子引入宿主細(xì)胞和篩選分子引入宿主細(xì)胞和篩選鑒定鑒定l1. 重組重組D

8、NA引入宿主細(xì)胞引入宿主細(xì)胞原核生物細(xì)胞是很好的受體細(xì)胞容易攝取外界的DNA，增殖快，基因組簡單，便于培養(yǎng)和基因操作。大腸桿菌、藍(lán)藻、農(nóng)桿菌等。l2. 重組體克隆的篩選與鑒定重組體克隆的篩選與鑒定23 重組DNA技術(shù)藍(lán)白斑篩選藍(lán)白斑篩選23 重組DNA技術(shù)轉(zhuǎn)基因植物篩選轉(zhuǎn)基因植物篩選23 重組DNA技術(shù)l 23.5 基因工程的應(yīng)用及其成果簡介基因工程的應(yīng)用及其成果簡介l 基因工程干擾素、人生長素、人胰島素、乙肝疫苗、紅細(xì)胞生成素、血纖維蛋白溶酶原激活劑（溶栓藥）等。l 基因工程農(nóng)作物新品種也已在一些國家在大田種植，如抗蟲棉、抗蟲玉米、耐儲(chǔ)黃瓜等。l 1. 生產(chǎn)新型疫苗生產(chǎn)新型疫苗l 2. 生產(chǎn)

9、人胰島素生產(chǎn)人胰島素l 3. 生產(chǎn)人生長激素生產(chǎn)人生長激素l 4. 生產(chǎn)干擾素生產(chǎn)干擾素23 重組DNA技術(shù)l5. 動(dòng)、植物基因工程動(dòng)、植物基因工程l轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物l（1）模式動(dòng)物）模式動(dòng)物 模式動(dòng)物可用來揭示生物學(xué)困難領(lǐng)域中的許多奧妙，像人腦、免疫系統(tǒng)和胚胎發(fā)育等。 在試驗(yàn)遺傳病的新療法中，模式動(dòng)物也很有用。癌鼠；轉(zhuǎn)基因猴。23 重組DNA技術(shù)23 重組DNA技術(shù)2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 綠色熒光蛋白（GFP）Osamu Shimomura（下村修） Martin Chalfie（馬丁沙爾菲） Roger Y. Tsien（錢永健，錢學(xué)森的堂侄）23 重組DNA技術(shù)GFP and dsR

10、ed23 重組DNA技術(shù)23 重組DNA技術(shù)23 重組DNA技術(shù)l（2）生物反應(yīng)器動(dòng)物）生物反應(yīng)器動(dòng)物生物反應(yīng)器動(dòng)物：利用其乳腺分泌藥用蛋白質(zhì)來制藥的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。羊-乳球蛋白啟動(dòng)子、-抗胰蛋白酶。l（3）供體動(dòng)物）供體動(dòng)物英國科學(xué)家在1992年12月成功培育出轉(zhuǎn)基因豬，其心臟帶有人類的成分；豬心臟來代替人心臟用于移植手術(shù)。23 重組DNA技術(shù)l轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因植物抗病、抗蟲、抗除草劑、抗逆、作物的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、果蔬儲(chǔ)存、作物的固氮能力、藥物生產(chǎn)及環(huán)境美化等。l（1）抗蟲植物）抗蟲植物 蘇云金桿菌、毒蛋白。23 重組DNA技術(shù)l（2）抗除草劑植物）抗除草劑植物草甘磷是一種廣譜除草劑。它的靶位點(diǎn)在葉綠

11、體中的EPSP合成酶。由于阻斷芳香族氨基酸的合成，植物最終會(huì)死亡。l（3）改良藥改良藥用植物用植物日本科學(xué)家用重組DNA技術(shù)提高了鎮(zhèn)靜藥莨莞堿合成的效率。l（4）生產(chǎn)疫苗的植物）生產(chǎn)疫苗的植物土豆生產(chǎn)疫苗。23 重組DNA技術(shù)l 6.基因診斷和基因治療基因診斷和基因治療l 1990年，首例應(yīng)用基因治療，治愈一名四歲女孩的腺苷脫氨酶缺乏癥。采用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移腺苷脫氨酶基因。l 基因治療基因：單基因疾病基因?qū)е孪佘彰摪泵溉狈ΠY、鐮刀形貧血病等；腫瘤抑制物基因和腫瘤形成基因等。l 腺病毒、脂質(zhì)體和單皰疹病毒等囊性纖維化病、帕金森氏病。愛滋病和癌癥。23 重組DNA技術(shù)全合成基因組全合成基因組23 重

12、組DNA技術(shù)l23.6 遺傳工程的風(fēng)險(xiǎn)和倫理學(xué)問題遺傳工程的風(fēng)險(xiǎn)和倫理學(xué)問題l1. 對人的影響對人的影響 “超級細(xì)菌”、對宗教、習(xí)俗和生活方式的影響。 用抗菌素抗性基因整合的轉(zhuǎn)基因食品的利用，遭到一部分人的反對。因?yàn)槿藗儞?dān)心以后會(huì)有太多的抗抗菌素生物產(chǎn)生，甚至產(chǎn)生無法對付的超級病菌。23 重組DNA技術(shù)l2. 對環(huán)境的影響對環(huán)境的影響 轉(zhuǎn)基因的逃逸；超級細(xì)菌；超級雜草；對生物多樣性的影響。 利用抗除草劑基因篩選的辦法，也由于人們擔(dān)心會(huì)產(chǎn)生超級雜草，而遇到類似的情況。l3. 嚴(yán)格的釋放規(guī)定嚴(yán)格的釋放規(guī)定 生物安全實(shí)驗(yàn)室規(guī)則。What is Genetically Modified？什么是轉(zhuǎn)基因？

13、“轉(zhuǎn)基因食品”（Genetically Modified Foods)l是指用轉(zhuǎn)基因生物制造、生產(chǎn)的食品、是指用轉(zhuǎn)基因生物制造、生產(chǎn)的食品、食品原料及食品添加物等。食品原料及食品添加物等。l簡稱：簡稱：GMF 第一批列入目錄的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物第一批列入目錄的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物l大豆：大豆：大豆種子、大豆、大豆粉、大豆油、豆粕大豆種子、大豆、大豆粉、大豆油、豆粕l玉米：玉米種子、玉米、玉米油、玉米粉玉米：玉米種子、玉米、玉米油、玉米粉l油菜：油菜：油菜種子、油菜籽、油菜籽油、油菜籽粕油菜種子、油菜籽、油菜籽油、油菜籽粕l棉花種子棉花種子l番茄：番茄種子、鮮番茄、番茄醬番茄：番茄種子、鮮番茄、番茄醬小西紅柿是轉(zhuǎn)基因食品么？小西紅柿是轉(zhuǎn)基因食品么？ 為什么會(huì)對為什么會(huì)對轉(zhuǎn)基因食品轉(zhuǎn)基因食品有恐懼心理有恐懼心理？轉(zhuǎn)基因食品的安