蛋白酶活力的測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)三 蛋白酶活力的測(cè)定一、目的掌握用分光光度計(jì)法測(cè)定蛋白酶活力的原理與操作技術(shù)。二、原理蛋白酶水解酪蛋白，其產(chǎn)物酪氨酸能在堿性條件下使福林酚試劑還原，生成鉬藍(lán)與鎢藍(lán)，以比色法測(cè)定。三、試劑及儀器1 福林酚試劑稱(chēng)取50g鎢酸鈉(Na2WO42H2O)，12.5g鉬酸鈉(Na2MoO42H2O)，置入1000mL原底燒瓶中，加350mL水，25mL85%磷酸，50mL濃鹽酸，文火微沸回流10h，取下回流冷凝器，加50g硫酸鋰(Li2SO4)和25mL水，混勻后，加溴水脫色，直至溶液呈金黃色，再微沸15min，驅(qū)除殘余的溴，冷卻，用4號(hào)耐酸玻璃過(guò)濾器抽濾，濾液用水稀釋至500mL。使用時(shí)用2倍體積

2、的水稀釋。2 0.4mol/L碳酸鈉溶液：稱(chēng)取42.4g碳酸鈉，用水溶解并定容至1000mL。3 0.4mol/L三氯乙酸溶液：稱(chēng)取65.5g三氯乙酸，用水溶解并定容至1000mL。4 2%酪蛋白溶液 稱(chēng)取2.00g酪蛋白(又名干酪素)，加約40mL水和23滴濃氨水，于沸水浴中加熱溶解，冷卻后，用pH7.2磷酸緩沖溶液稀釋定容至100mL，貯存于冰箱中。5 pH7.2磷酸緩沖液 0.2mol/L 磷酸二氫鈉溶液：稱(chēng)取31.2g磷酸二氫鈉(NaH2PO42H2O)，用水溶解稀釋至1000mL；0.2mol/L 磷酸氫二鈉溶液：稱(chēng)取71.6g磷酸氫二鈉(Na2HPO412H2O)，用水溶解稀釋至1

3、000mL； pH7.2磷酸緩沖溶液：取28mL 0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液和72mL 0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液，用水稀釋至1000mL。6 標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1g DL-酪氨酸，加少量0.2mol/L鹽酸溶液(取1.7mL濃鹽酸，用水稀釋至100mL)，加熱溶解，用水定容至1000mL，每毫升含DL-酪氨酸100微克。7 儀器：分光光度計(jì)、試管四、操作步驟1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取9支試管，按下表將標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液稀釋。編 號(hào)012345678標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液 (mL)100 mg/mL012345678水 (mL)1098765432稀釋酪氨酸溶液濃度 (mg/mL)0102030

4、4050607080在上述各管中各取1mL，分別加入5mL 0.4mol/L碳酸鈉溶液，1mL福林酚試劑，于400C水浴顯色20min，在680nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得吸光度為1時(shí)相當(dāng)?shù)睦野彼醡g數(shù)，即為K值。2 酶液的制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取酶粉0.5g，用pH7.2磷酸緩沖溶液定容至100mL，置入400C水浴浸取0.5h，用紗布過(guò)濾。根據(jù)酶活力的高低，再用pH7.2磷酸緩沖溶液稀釋一定倍數(shù)(使其測(cè)定的吸光度在0.20.4范圍內(nèi)為宜，約4-5倍)。3 測(cè)定 取一支離心管，加入1mL稀釋酶液，置入400C水浴中預(yù)熱35min，再加入預(yù)熱至400C 的2%酪蛋白溶液1mL，準(zhǔn)確

5、及時(shí)保溫10min。立即加入2mL0.4mol/L三氯乙酸溶液，15min后離心分離或用濾紙過(guò)濾。吸取1mL清液，加5mL0.4mol/L碳酸鈉溶液，最后加入1mL福林酚試劑，搖勻，于400C水浴中顯色20min。 另取一支離心管為空白管。在空白管中先加入1mL稀釋酶液，再加入2mL0.4mol/L三氯乙酸溶液，再加1mL2% 酪蛋白溶液，15min后離心分離或用濾紙過(guò)濾。吸取1mL清液，加5mL 0.4mol/L碳酸鈉溶液，最后加入1mL福林酚試劑，搖勻，于400C水浴中顯色20min。以空白為對(duì)照，在680nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。4.計(jì)算蛋白酶活力單位的定義：1g酶粉，在400C，pH7.2下

6、，每分鐘水解酪蛋白為酪氨酸的微克(mg)數(shù)。蛋白酶活力 = 式中： E試管的吸光度 4離心管中反應(yīng)液的總體積，mL 10反應(yīng)10min N稀釋倍數(shù) W酶粉稱(chēng)取量，g K為Y=1時(shí)X的值 即1.14結(jié)果與分析：OD680CK 1 2 30 3.85 2.05 3.71表面上看2號(hào)樣的數(shù)據(jù)看似很有可以于是從上面的表格分析，平均的習(xí)慣值為 樣品標(biāo)準(zhǔn)誤差為根據(jù)格拉布斯法則來(lái)判斷樣品2數(shù)據(jù)是否舍去。1Xp=質(zhì)疑的數(shù)據(jù)=平均值為置信水平N為樣品數(shù)S為樣品標(biāo)準(zhǔn)誤差 所以樣品2的數(shù)據(jù)屬于正常范圍內(nèi)。即在處理數(shù)據(jù)的時(shí)候不應(yīng)該將樣品2忽略舍去。于是樣品的酶的活力。樣品1酶活力為702.24樣品2酶活力為373.92樣品3酶活力為676.704平均酶活力為： 584.288從上述的實(shí)驗(yàn)，樣品2的波動(dòng)的原因可以歸結(jié)為一、有可能是在酶液移液的時(shí)候有過(guò)多的損失而造成了酶活力很少的偏差 二