多克隆抗體的制備

1、多克隆抗體的制備及抗體活性測定 主要內(nèi)容主要內(nèi)容多克隆抗體制備的基本原理多克隆抗體制備的基本原理多克隆抗體制備的操作步驟多克隆抗體制備的操作步驟抗體活性的實(shí)驗原理、操作流程和結(jié)果判斷抗體活性的實(shí)驗原理、操作流程和結(jié)果判斷原原 理理1、克隆、克隆(clone)： 是指無性繁殖細(xì)胞系，由單一個祖先細(xì)胞是指無性繁殖細(xì)胞系，由單一個祖先細(xì)胞分裂繁殖而形成的一簇細(xì)胞系。在這個家族的所有成員中，分裂繁殖而形成的一簇細(xì)胞系。在這個家族的所有成員中，如無發(fā)生突變其基因是完全相同的。如無發(fā)生突變其基因是完全相同的。2、多克隆抗體（、多克隆抗體（polyclonal antibody, pAb）：用一種包含多）：

2、用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動物，可刺激機(jī)體種抗原決定簇的抗原免疫動物，可刺激機(jī)體多個多個B細(xì)胞克細(xì)胞克隆隆產(chǎn)生針對產(chǎn)生針對多種抗原表位多種抗原表位的不同抗體。所獲得的免疫血清的不同抗體。所獲得的免疫血清實(shí)際上是含有實(shí)際上是含有多種抗體的混合物，即多克隆抗體多種抗體的混合物，即多克隆抗體。3、單克隆抗體（、單克隆抗體（monoclonal antibodies, mAb）：由一個）：由一個識別一種抗原表位識別一種抗原表位的的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的同源抗體。高度均細(xì)胞克隆產(chǎn)生的同源抗體。高度均一、特異性強(qiáng)、效價高、少或無交叉反應(yīng)性。一、特異性強(qiáng)、效價高、少或無交叉反應(yīng)性。第一代抗體是傳統(tǒng)的抗體制

3、備方法即利用抗原免疫動物第一代抗體是傳統(tǒng)的抗體制備方法即利用抗原免疫動物后獲得抗體，稱為多克隆抗體（后獲得抗體，稱為多克隆抗體（polyclonal antibody）；）；第二代抗體是通過雜交瘤技術(shù)制備出針對抗原中某一抗第二代抗體是通過雜交瘤技術(shù)制備出針對抗原中某一抗原決定簇的抗體稱為單克隆抗體原決定簇的抗體稱為單克隆抗體(monoclonal antibody, McAb)；第三代抗體是利用基因工程技術(shù)制備而來，稱為基因工第三代抗體是利用基因工程技術(shù)制備而來，稱為基因工程抗體程抗體(genetic engineering antibody)?？贵w發(fā)展歷史抗體發(fā)展歷史 多克隆抗體制備流程多克

4、隆抗體制備流程免疫原的制備免疫原的制備免疫動物免疫動物免疫血清的收集免疫血清的收集免疫血清的鑒定免疫血清的鑒定免疫血清的保存免疫血清的保存 免疫原（免疫原（immunogen）： 指能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞指能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞 的抗原最重要的性質(zhì)是的抗原最重要的性質(zhì)是免疫原性（免疫原性（immunogenicity）. 免疫原種類：免疫原種類： 天然抗原、人工合成抗原；天然抗原、人工合成抗原； 蛋白質(zhì)、多糖、脂類、核酸抗原。蛋白質(zhì)、多糖、脂類、核酸抗原。 免疫原的制備免疫原的制備 細(xì)胞性抗原制備：細(xì)胞性抗原制備： 綿羊紅細(xì)胞（綿羊紅細(xì)胞（SRB

5、C）- 溶血素；溶血素； 細(xì)菌細(xì)菌- 抗菌抗體（動物免疫血清）?？咕贵w（動物免疫血清）。 可溶性抗原制備：可溶性抗原制備： 指蛋白質(zhì)、多糖和脂類等。指蛋白質(zhì)、多糖和脂類等。細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎反復(fù)凍融法反復(fù)凍融法超聲破碎法超聲破碎法自溶法自溶法酶處理法酶處理法表面活性劑處理法表面活性劑處理法 超速離心分離超速離心分離： 是一種根據(jù)分離物質(zhì)的比重特點(diǎn)，通過差速或梯度密是一種根據(jù)分離物質(zhì)的比重特點(diǎn)，通過差速或梯度密 度離心，將分子大小不同的抗原顆粒分開的方法，只度離心，將分子大小不同的抗原顆粒分開的方法，只 適宜少數(shù)大分子物質(zhì)的分離。適宜少數(shù)大分子物質(zhì)的分離。 選擇性沉淀：選擇性沉淀： 選擇某抗原理

6、化特性，采用相應(yīng)沉淀劑或溶液環(huán)境，選擇某抗原理化特性，采用相應(yīng)沉淀劑或溶液環(huán)境， 如：如： 核酸去除核酸去除 鹽析沉淀法鹽析沉淀法 有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法 高分子聚合物沉淀法高分子聚合物沉淀法 50% 50%飽和硫酸銨鹽溶液可沉淀析出血清球蛋白；飽和硫酸銨鹽溶液可沉淀析出血清球蛋白； 8% 8%12%PEG600012%PEG6000可沉淀可沉淀IgGIgG。粗分離粗分離 超濾法：超濾法： 利用孔徑大小不同的特制薄膜對不同分子大小的抗原利用孔徑大小不同的特制薄膜對不同分子大小的抗原物質(zhì)進(jìn)行濾篩。物質(zhì)進(jìn)行濾篩。 電泳電泳精分離精分離 層析法：層析法： 凝膠過濾層析凝膠過濾層析 離子交換層析

7、離子交換層析 親和層析親和層析 疏水層析疏水層析 反相層析反相層析 鑒定純化蛋白的含量、相對分子的質(zhì)量、純度以及免鑒定純化蛋白的含量、相對分子的質(zhì)量、純度以及免疫學(xué)活性。疫學(xué)活性。蛋白含量蛋白含量凱氏定氮（紫外光凱氏定氮（紫外光280nm等），等），Lowry分子質(zhì)量分子質(zhì)量電泳、質(zhì)譜電泳、質(zhì)譜蛋白純度蛋白純度電泳、電泳、HPLC免疫原性免疫原性免疫印跡免疫印跡 、免疫雙擴(kuò)散、免疫組化、免疫雙擴(kuò)散、免疫組化蛋白活性蛋白活性 ELISA、XTT蛋白結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)紅外光譜、氨基酸測序紅外光譜、氨基酸測序蛋白等電點(diǎn)蛋白等電點(diǎn)IEF蛋白鑒定蛋白鑒定免疫佐劑免疫佐劑 某些物質(zhì)與抗原一起或先于抗原注入機(jī)體，

8、可增某些物質(zhì)與抗原一起或先于抗原注入機(jī)體，可增強(qiáng)機(jī)體對該抗原的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)強(qiáng)機(jī)體對該抗原的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型，此類物質(zhì)稱為答類型，此類物質(zhì)稱為免疫佐劑免疫佐劑(immunoadjuvant)，簡稱佐劑。，簡稱佐劑。 佐劑的種類佐劑的種類佐劑一般包括以下幾類：佐劑一般包括以下幾類： 無機(jī)佐劑：無機(jī)佐劑：如氫氧化鋁、明釩等；如氫氧化鋁、明釩等； 生物性佐劑：生物性佐劑：如結(jié)核分枝桿菌、卡介苗、小棒狀桿菌、百日如結(jié)核分枝桿菌、卡介苗、小棒狀桿菌、百日咳桿菌、革蘭陰性桿菌內(nèi)毒素、霍亂毒素的咳桿菌、革蘭陰性桿菌內(nèi)毒素、霍亂毒素的B B亞單位、胞壁酰亞單位、胞壁酰二肽和細(xì)胞因子

9、等；二肽和細(xì)胞因子等； 人工合成佐劑：人工合成佐劑：如雙鏈多聚肌苷酸：胞苷酸（如雙鏈多聚肌苷酸：胞苷酸（poly Ipoly I：C C）、）、雙鏈多聚腺苷酸：尿苷酸（雙鏈多聚腺苷酸：尿苷酸（poly Apoly A：U U）；油劑：如弗氏完全）；油劑：如弗氏完全佐劑、花生油乳劑等；佐劑、花生油乳劑等； 納米佐劑納米佐劑 弗氏佐劑（弗氏佐劑（Freunds adjuvant）分為弗氏不完全佐劑和完全佐劑兩種：分為弗氏不完全佐劑和完全佐劑兩種： 前者是由油劑（礦物油或花生油）和乳化劑（羊毛脂前者是由油劑（礦物油或花生油）和乳化劑（羊毛脂或吐溫或吐溫-80）按）按1：11：5比例混合而成；比例混合

10、而成； 后者由弗氏不完全佐劑加卡介苗組成。在免疫動物時，后者由弗氏不完全佐劑加卡介苗組成。在免疫動物時，先將弗氏佐劑與抗原等比混勻，制成先將弗氏佐劑與抗原等比混勻，制成“油包水油包水”乳化乳化液。液。 佐劑與抗原混合乳化的方法：佐劑與抗原混合乳化的方法： 研磨法研磨法 攪拌混合法攪拌混合法 佐劑的免疫生物學(xué)作用佐劑的免疫生物學(xué)作用 增強(qiáng)抗原免疫原性：使無或微弱免疫原性的物質(zhì)變成增強(qiáng)抗原免疫原性：使無或微弱免疫原性的物質(zhì)變成持久或強(qiáng)的免疫原；持久或強(qiáng)的免疫原； 增強(qiáng)機(jī)體對抗原刺激的反應(yīng)性，提高初次應(yīng)答和再次增強(qiáng)機(jī)體對抗原刺激的反應(yīng)性，提高初次應(yīng)答和再次應(yīng)答所產(chǎn)生的抗體滴度；應(yīng)答所產(chǎn)生的抗體滴度；

11、 改變抗體類型，使產(chǎn)生抗體由改變抗體類型，使產(chǎn)生抗體由IgM型轉(zhuǎn)變?yōu)樾娃D(zhuǎn)變?yōu)镮gG型；型； 引起或增強(qiáng)遲發(fā)性超敏反應(yīng)。引起或增強(qiáng)遲發(fā)性超敏反應(yīng)。佐劑的作用機(jī)制佐劑的作用機(jī)制佐劑的作用機(jī)制歸納起來主要有如下幾種：佐劑的作用機(jī)制歸納起來主要有如下幾種： 可增強(qiáng)抗原的表面積和改變抗原活性基團(tuán)構(gòu)型，從而增強(qiáng)可增強(qiáng)抗原的表面積和改變抗原活性基團(tuán)構(gòu)型，從而增強(qiáng) 抗原的免疫原性?？乖拿庖咴?。 佐劑與抗原混合一起注入機(jī)體，可改變抗原的物理性狀，佐劑與抗原混合一起注入機(jī)體，可改變抗原的物理性狀，形成抗原儲存庫，延長抗原在局部組織的滯留時間，有利于形成抗原儲存庫，延長抗原在局部組織的滯留時間，有利于抗原的緩慢

12、釋放?？乖木徛尫拧?增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬作用（被佐劑吸附的抗原易被吞噬細(xì)增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬作用（被佐劑吸附的抗原易被吞噬細(xì)胞吞噬），促進(jìn)對抗原的處理，刺激淋巴細(xì)胞增生，從而增胞吞噬），促進(jìn)對抗原的處理，刺激淋巴細(xì)胞增生，從而增強(qiáng)和擴(kuò)大免疫應(yīng)答的效應(yīng)。強(qiáng)和擴(kuò)大免疫應(yīng)答的效應(yīng)。 動物免疫動物免疫免疫動物的選擇：免疫動物的選擇： 抗原來源與動物種屬的關(guān)系：抗原的來源與免疫動物種屬抗原來源與動物種屬的關(guān)系：抗原的來源與免疫動物種屬差異越遠(yuǎn)，其免疫源性越強(qiáng)，免疫效果越好，而同種系或差異越遠(yuǎn)，其免疫源性越強(qiáng)，免疫效果越好，而同種系或親緣關(guān)系越近，免疫效果越差。親緣關(guān)系越近，免疫效果越差。 動物個體的選擇

13、：適齡、健康、體重符合要求的正常動物動物個體的選擇：適齡、健康、體重符合要求的正常動物（以雄性為佳）；抗體需要量少時，選用家兔、豚鼠和雞（以雄性為佳）；抗體需要量少時，選用家兔、豚鼠和雞等小動物；抗體需要量大時，可選用綿羊、山羊、馬、驢等小動物；抗體需要量大時，可選用綿羊、山羊、馬、驢等大動物。等大動物。 免疫方法免疫方法 選定動物后，在免疫過程中應(yīng)考慮免疫劑量、免疫途徑、選定動物后，在免疫過程中應(yīng)考慮免疫劑量、免疫途徑、免疫次數(shù)、免疫間隔等因素。免疫次數(shù)、免疫間隔等因素。 免疫原的劑量：免疫原的接種劑量按免疫原性的強(qiáng)弱、動免疫原的劑量：免疫原的接種劑量按免疫原性的強(qiáng)弱、動物的個體狀態(tài)和免疫時

14、間來確定。首次免疫時，劑量不宜物的個體狀態(tài)和免疫時間來確定。首次免疫時，劑量不宜過大，以免產(chǎn)生免疫麻痹。過大，以免產(chǎn)生免疫麻痹。 免疫途徑通常有皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、腹腔、淋巴免疫途徑通常有皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、腹腔、淋巴 結(jié)結(jié)等，視不同的免疫方案而異。對于不易獲取的寶貴抗原可采等，視不同的免疫方案而異。對于不易獲取的寶貴抗原可采用淋巴結(jié)免疫法。用淋巴結(jié)免疫法。免疫間隔時間是影響抗體產(chǎn)生的重要因素，其中首次與第二免疫間隔時間是影響抗體產(chǎn)生的重要因素，其中首次與第二次免疫的間隔時間尤為重要，一般以次免疫的間隔時間尤為重要，一般以1020天為佳，二次后天為佳，二次后間隔時間一般為間隔時間一般為

15、710天，若間隔時間太長，則刺激減弱，天，若間隔時間太長，則刺激減弱，抗體效價不高?？贵w效價不高。 動物采血動物采血 采集免疫血清前，要預(yù)先測試抗體效價測定，若效價達(dá)到要采集免疫血清前，要預(yù)先測試抗體效價測定，若效價達(dá)到要求，應(yīng)在末次免疫后一周及時采血，否則抗體效價會下降。求，應(yīng)在末次免疫后一周及時采血，否則抗體效價會下降。 頸動脈采血法頸動脈采血法 心臟采血法心臟采血法 靜脈采血法靜脈采血法免疫血清的鑒定免疫血清的鑒定 表達(dá)量的測定：表達(dá)量的測定：顆粒性抗原可采用凝集試驗，可溶性顆粒性抗原可采用凝集試驗，可溶性抗原常用雙向免疫擴(kuò)散試驗、抗原常用雙向免疫擴(kuò)散試驗、ELISA等方法。等方法。 玻

16、片凝集試驗玻片凝集試驗 肥達(dá)試驗（微量法）肥達(dá)試驗（微量法） ELISA玻片凝集試驗玻片凝集試驗 玻片凝集試驗為定性試驗方法，一般用已知抗體作為診斷玻片凝集試驗為定性試驗方法，一般用已知抗體作為診斷血清、與受檢顆?？乖缇夯蚣t細(xì)胞懸液各加血清、與受檢顆?？乖缇夯蚣t細(xì)胞懸液各加1滴在玻片滴在玻片上，混勻，數(shù)分鐘后即可用肉眼觀察凝集結(jié)果，出現(xiàn)顆粒上，混勻，數(shù)分鐘后即可用肉眼觀察凝集結(jié)果，出現(xiàn)顆粒凝集的為陽性反應(yīng)。凝集的為陽性反應(yīng)。 此法簡便、快速，一般用來鑒定菌種或分型，也用于人類此法簡便、快速，一般用來鑒定菌種或分型，也用于人類ABO血型的鑒定。血型的鑒定。肥達(dá)試驗（肥達(dá)試驗（Widal

17、test）是用已知的傷寒桿菌）是用已知的傷寒桿菌O、H抗原和抗原和甲、乙型副傷寒桿菌甲、乙型副傷寒桿菌H抗原與病人血清做定量凝集試驗，抗原與病人血清做定量凝集試驗，以測定患者血清中有無相應(yīng)抗體，根據(jù)抗體含量的多少以以測定患者血清中有無相應(yīng)抗體，根據(jù)抗體含量的多少以及增長情況判斷陽性。及增長情況判斷陽性。此法一般用來幫助診斷傷寒及副傷寒。此法一般用來幫助診斷傷寒及副傷寒。 肥達(dá)試驗肥達(dá)試驗ELISA酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(ELISA) 即將已知的抗原或抗體吸附即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的技

18、術(shù)。進(jìn)行的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測大分子抗原和特異性抗體等，具有快該技術(shù)可用于檢測大分子抗原和特異性抗體等，具有快速、靈敏、簡便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。速、靈敏、簡便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。 特異性鑒定：特異性鑒定：抗體特異性鑒定常用雙向免疫擴(kuò)散法、免疫電泳法?？贵w特異性鑒定常用雙向免疫擴(kuò)散法、免疫電泳法。 純度鑒定：純度鑒定： 抗體純度的鑒定可采用抗體純度的鑒定可采用SDS-聚丙酰胺凝膠電泳（聚丙酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、）、雙向擴(kuò)散試驗、免疫電泳等方法。雙向擴(kuò)散試驗、免疫電泳等方法。 IgG含有重鏈和輕鏈，純含有重鏈和輕鏈，純IgG的的SDS-PAGE結(jié)果應(yīng)有兩條蛋白電泳結(jié)果應(yīng)有兩條

19、蛋白電泳帶（分子量約帶（分子量約53kD和和22kD），若出現(xiàn)多條電泳帶則表明制備的抗），若出現(xiàn)多條電泳帶則表明制備的抗體混有雜蛋白，需進(jìn)一步純化。體混有雜蛋白，需進(jìn)一步純化。 結(jié)合活性鑒定：結(jié)合活性鑒定：測定抗體親力的方法較多，如平衡透析法、測定抗體親力的方法較多，如平衡透析法、ELISA或或RIA競爭結(jié)合試驗等。競爭結(jié)合試驗等?？贵w親合常數(shù)測定抗體親合常數(shù)測定 親合常數(shù)測定采用非競爭酶免疫試驗法：親合常數(shù)測定采用非競爭酶免疫試驗法： 先確定在某一抗原濃度時抗體可以達(dá)到飽和；先確定在某一抗原濃度時抗體可以達(dá)到飽和； 以該抗原濃度為實(shí)驗條件，飽和時的以該抗原濃度為實(shí)驗條件，飽和時的OD值作為值

20、作為OD-100，找出找出OD-50時的抗體濃度和相應(yīng)的抗原濃度；時的抗體濃度和相應(yīng)的抗原濃度； 根據(jù)公式根據(jù)公式Ka= n-1 計算抗體的計算抗體的Ka值。值。 2(nAbt-Ab t)t代表測定時的溫度；代表測定時的溫度；n=Abt/Abt；Abt 表示抗原濃度較高的表示抗原濃度較高的Amax的一半；的一半；Abt表示抗原濃度較低的表示抗原濃度較低的Amax的一半。的一半。 對于單克隆抗體，一般親合力要求對于單克隆抗體，一般親合力要求107L/mol，好的單抗多，好的單抗多大于大于109 L/mol。 多克隆抗體的保存多克隆抗體的保存 4保存（保存（6個月）個月）低溫保存（低溫保存（-70

21、 -20 ，5年）年）真空干燥保存（真空干燥保存（5 10年）年）注意點(diǎn)：保存前需經(jīng)除菌注意點(diǎn)：保存前需經(jīng)除菌 保存液含防腐劑保存液含防腐劑 避免反復(fù)凍融（分裝）避免反復(fù)凍融（分裝） 半抗原性免疫原的制備半抗原性免疫原的制備 載體選擇：載體選擇：（1）蛋白質(zhì)類：常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蛋）蛋白質(zhì)類：常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蛋白等，其中以牛血清白蛋白最為常用。白等，其中以牛血清白蛋白最為常用。（2）多肽類聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也是一類良）多肽類聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也是一類良好的載體，常用的有多聚賴氨酸。好的載體，常用的有多聚賴氨酸。（3）大分

22、子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纖維素）、羧甲基纖維素(CMC)等皆可與半抗原結(jié)合，加入福氏完全佐劑可誘導(dǎo)動物等皆可與半抗原結(jié)合，加入福氏完全佐劑可誘導(dǎo)動物產(chǎn)生良好的抗體。產(chǎn)生良好的抗體。 連接方法：連接方法： 物理法：是用物理吸附法將載體與半抗原連接，其原物理法：是用物理吸附法將載體與半抗原連接，其原理是通過電荷和微孔來吸半抗原，吸附載體主要有理是通過電荷和微孔來吸半抗原，吸附載體主要有PVP和和CMC等；等； 化學(xué)法：是利用某些功能基團(tuán)把半抗原連接到蛋白質(zhì)化學(xué)法：是利用某些功能基團(tuán)把半抗原連接到蛋白質(zhì)類或多肽類聚合物載體上。不同的半抗原應(yīng)選用不類或多肽類聚合物載體上。不同的半