生物樣品前處理

1、生物樣品前處理制作人：葉超 1 234生物樣品種類目錄生物樣品儲(chǔ)存生物樣品預(yù)處理克服基質(zhì)效應(yīng)方法DistributionMetabolismAbsorptionExcretion生物樣品中藥物的分析測(cè)定是定量描述藥物體內(nèi)過(guò)程、獲得藥代參數(shù)的重要手段之一藥物濃度低（血液中藥物濃度、一般處于ng-pg級(jí)水平）干擾組分多（血液成分及其復(fù)雜，包括基質(zhì)，內(nèi)源性物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物，含有數(shù)百乃至幾千種化合物）藥物在體內(nèi)除原型還有代謝產(chǎn)物以及和內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合多種形式存在體內(nèi)生物樣品分析特點(diǎn)體內(nèi)生物樣品分析特點(diǎn)生物樣品種類生物樣品種類選取的原則能夠反應(yīng)出藥物濃度與藥物效應(yīng)之間的關(guān)系易于獲取便于處理、適合分析根據(jù)不

2、同目的要求進(jìn)行選取均勻生物樣品生物樣品種類血液（全血、血漿、血清）尿液、唾液、膽汁、乳汁、腦脊液、淋巴液、汗液等非均勻生物樣品心、肝、腎、脾、肺、腦、胃、腸、子宮、肌肉、皮膚等組織、器官全血全血全血包括液體成分的血漿和分散懸浮于其中的血細(xì)胞全血不易保存，且血細(xì)胞中含有很多干擾物質(zhì)，影響測(cè)定，故較少用全血測(cè)定藥物濃度。僅用于血漿藥物濃度太低或者血漿藥物濃度波動(dòng)較大，且難以控制的藥物，如環(huán)抱霉素A。血漿血漿將采取的血液置含有抗凝劑（如肝素、EDTA)的試管中，混合后，3000-4000r/min離心，分離紅細(xì)胞，上清液即為血漿。測(cè)定血中藥物濃度通常是指測(cè)定血漿或血清中的藥物濃度，而不是指含有血細(xì)胞

3、的全血中 的藥物濃度。血清血清血清是采血后不加任何抗凝劑，于室溫下靜置15-30min，待其自然凝結(jié)后，離心，分離出上清液。血清較血漿顏色更淺，較血漿少了大部分纖維蛋白，更易進(jìn)行處理，且血漿及血清中的藥物濃度測(cè)定值通常是相同的。選擇血漿or 血清u選擇血漿理由：1)一般血漿中藥物濃度高于血清中藥物濃度2)血清形成過(guò)程中，血塊凝固時(shí)，往往易造成吸附損失3)血清需要采血放置一段時(shí)間才可制得，對(duì)不穩(wěn)定的化合物影響較大4)血漿則可經(jīng)采血后立刻離心，分離血漿低溫保存u選擇血清理由：1)血漿中蛋白稍微多，可能會(huì)在SPE中產(chǎn)生堵塞柱子情況2)血漿中含有抗凝物質(zhì)（肝素或EDTA)可能會(huì)干擾化合物檢測(cè)生物樣品的

4、儲(chǔ)存一、冷藏或冷凍采樣后除了立即分析外，為防止藥物發(fā)生變化，應(yīng)：u短期保存，可4冷藏u長(zhǎng)期保存，可-20冷凍，不要反復(fù)凍融（大部分藥物）u-80，阿莫西林等抗生素二、有時(shí)，還應(yīng)考慮加入穩(wěn)定劑酶抑制劑：一些酯類藥物，如普魯卡因、阿糖胞苷，易受血漿酯酶作用而發(fā)生水解，而應(yīng)在采樣后立即加入酶抑制劑如氟化鈉?？寡趸瘎阂恍┮籽趸奈镔|(zhì)，可加入VC或其它氧化劑。如血漿中的兒茶酚類藥物常規(guī)保存僅4周，若加入適量的VC，則能保存10周。鹽酸班布特羅（前藥）體內(nèi)膽堿酯酶的作用下緩慢代謝阻斷水解毒扁豆堿(膽堿酯酶抑制劑）特布他林（代謝產(chǎn)物）生物樣品的儲(chǔ)存和預(yù)處理(添加酶抑制劑)生物樣品的儲(chǔ)存和預(yù)處理(避光）生物

5、樣品的儲(chǔ)存和預(yù)處理(PH值和溫度）生物樣品預(yù)處理目的123將藥物從綴合物（尿）或結(jié)合物中釋放出來(lái)，以測(cè)定藥物濃度將微量藥物從復(fù)雜介質(zhì)中純化、富集起來(lái)防止分析儀器的污染，提高測(cè)定靈敏度和選擇性生物樣品常用的處理方法一沉淀蛋白(PPT)液液萃取(LLE)固相萃取(SPE)u主要考慮生物樣品的種類、被測(cè)藥物的性質(zhì)和測(cè)定方法三個(gè)方面的問(wèn)題：沉淀蛋白u(yù)通過(guò)沉淀蛋白質(zhì)可以使結(jié)合的藥物釋放出來(lái)，達(dá)到對(duì)待測(cè)組分的提純和純化有機(jī)溶劑沉淀法加入中性鹽有機(jī)酸加入鋅鹽或銅鹽沉淀劑酶解法有機(jī)溶劑沉淀法原理加入水溶性有機(jī)溶劑，可使蛋白質(zhì)的分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變化常用有機(jī)溶劑種類乙腈、甲醇、丙酮、乙醇、四氫呋喃等操作實(shí)

6、例50l 血漿+150l甲醇 渦旋1min 3500rpm離心10min 取上清液進(jìn)樣分析有機(jī)溶劑沉淀法實(shí)例奧氮平有機(jī)溶劑沉淀法血漿或血清與有機(jī)溶劑的體積比為1:13，就可以將90%以上的蛋白質(zhì)除去，采用低溫低速3500r/min離心10min便可將析出的蛋白質(zhì)完全沉淀。經(jīng)驗(yàn)總結(jié)優(yōu)點(diǎn)操作簡(jiǎn)單，快速，精密度好，為方法開(kāi)發(fā)中優(yōu)先考慮使用的，特別在LC-MS方法中幾乎使用于所有小分子化合物，無(wú)論其極性大小化合物回收率接近100%，幾乎所有小分子化合物都被提取，尤其適用于代謝產(chǎn)物鑒定缺點(diǎn)只適用于樣品中濃度較高的藥物測(cè)定；樣品處理后仍然存在很多干擾物質(zhì)，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾；殘余的雜質(zhì)會(huì)堵塞色譜柱，污染儀器加

7、入強(qiáng)酸原理當(dāng)PH低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)以陽(yáng)離子形式存在，加入強(qiáng)酸，可與蛋白質(zhì)陽(yáng)離子形成不溶性鹽沉淀。常用有機(jī)溶劑種類10%三氯醋酸， 10%高氯酸等經(jīng)驗(yàn)總結(jié)血清與強(qiáng)酸的比例為1:0.6混合，高速離心，就可除去蛋白質(zhì)在酸性條件下分解的藥物不宜本法除蛋白頭孢地尼內(nèi)標(biāo) 頭孢克洛加入強(qiáng)酸實(shí)例酶解法原理在測(cè)定酸不穩(wěn)定及蛋白結(jié)合牢固的藥物，需用酶解法，最常用的酶是蛋白水解酶的枯草菌溶素，優(yōu)點(diǎn)可避免某些藥物在酸、及高溫條件下降解：對(duì)與蛋白質(zhì)結(jié)合牢固的藥物（保泰松、苯妥英鈉)，可顯著改善回收率加入中性鹽原理加入中性鹽，使溶液的粒子強(qiáng)度發(fā)生變化。中性鹽能將與蛋白質(zhì)水合的水置換出來(lái)，從而使蛋白質(zhì)脫水而沉淀。常

8、用中性鹽種類飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽、枸櫞酸鹽操作實(shí)例血清和飽和硫酸銨的比例為1:2，混合，離心10000r/min 1-2min，即可除去90%以上蛋白質(zhì)生物樣品常用的處理方法一沉淀蛋白(PPT)液液萃取(LLE)固相萃取(SPE)u主要考慮生物樣品的種類、被測(cè)藥物的性質(zhì)和測(cè)定方法三個(gè)方面的問(wèn)題：液-液提取方法（LLE）原理藥物在體內(nèi)吸收，需經(jīng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，所以多數(shù)藥物具有一定脂溶性生物樣品中大多數(shù)內(nèi)源性雜質(zhì)是強(qiáng)極性的水溶性物質(zhì)u可以根據(jù)藥物分子與基質(zhì)之間的極性差異，使用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑提取藥物，可一次性除去大部分雜質(zhì)LLE方法需是考慮的問(wèn)題一、溶劑的選擇原則相似相溶原理進(jìn)行選用沸點(diǎn)低、易

9、于揮散和濃集無(wú)毒、不易乳化具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和惰性和水不相溶常用液-液萃取溶劑正己烷叔丁基甲醚乙醚乙酸乙酯正丁醇極性增加二、有機(jī)溶劑和水相的體積比有機(jī)溶劑相和水相的體積比1:1或2:1，由實(shí)際情況決定，文獻(xiàn)中有10:1以上三、水相的PH值對(duì)于堿性藥物，最佳PH要高于藥物PKa1-2單位，對(duì)于酸性藥物，最佳PH要低于PKa1-2單位，使藥物分子以非電離的形式存在，從而更易溶于有機(jī)溶劑中操作實(shí)例LLE方法操作實(shí)例萃取劑LLE方法操作實(shí)例待測(cè)藥物：氯雷他定內(nèi)標(biāo)：地西泮LLE方法總結(jié)優(yōu)點(diǎn)選擇性高，可除去大部分雜質(zhì)對(duì)有機(jī)溶劑蒸發(fā)后復(fù)溶，可以對(duì)樣品進(jìn)行濃縮樣品較干凈，對(duì)儀器污染小不同PH體系中與不同的萃

10、取劑組合，可控制回收率，并降低基質(zhì)效應(yīng)缺點(diǎn)操作繁瑣，不能自動(dòng)化易乳化一般提取回收率較低不適用于極性大或者易揮發(fā)的化合物的提取由于需要揮發(fā)有機(jī)溶劑，對(duì)于熱不穩(wěn)定的化合物也不太適合，容器吸附的化合物也有一定的困難對(duì)于極性相差較大的化合物同時(shí)提取困難生物樣品常用的處理方法一沉淀蛋白(PPT)液液萃取(LLE)固相萃取(SPE)u主要考慮生物樣品的種類、被測(cè)藥物的性質(zhì)和測(cè)定方法三個(gè)方面的問(wèn)題：固相萃取技術(shù)(SPE)固相萃取(Solid Phase Extraction，簡(jiǎn)稱SPE)是從八十年代中期開(kāi)始發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)樣品前處理技術(shù)。由液固萃取和液相色譜技術(shù)相結(jié)合發(fā)展而來(lái)。主要通過(guò)固相填料對(duì)樣品組分的選擇

11、性吸咐及解吸過(guò)程，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的分離，純化和富集。主要目的在于降低樣品基質(zhì)干擾，提高檢測(cè)靈敏度固相萃取技術(shù)基本原理和方法基本原理采用選擇性吸附、選擇性洗脫的方式對(duì)樣品進(jìn)行富集、分離、純化，是一種包括液相和固相的物理萃取過(guò)程；也可以將其近似地看作一種簡(jiǎn)單的色譜過(guò)程較常用的方法是使液體樣品通過(guò)一吸附劑，保留其中被測(cè)物質(zhì)，再選用適當(dāng)強(qiáng)度溶劑沖去雜質(zhì)，然后用少量良溶劑洗脫被測(cè)物質(zhì)，從而達(dá)到快速分離凈化與濃縮的目的也可選擇性吸附干擾雜質(zhì)，而讓被測(cè)物質(zhì)流出基本方法固相萃取分離類型反相固相萃取硅膠上鍵合C18，C8，C2，苯基，腈基流動(dòng)相極性大于固定相，適合分離中小極性的化合物的萃取疏水性相互作用正相固相萃取

12、無(wú)鍵合硅膠、或硅膠上鍵合氰基、NH2、二醇基流動(dòng)相極性小于固定相，適合于極性的化合物的萃取親水性相互作用離子交換萃取硅膠基質(zhì)的離子交換官能團(tuán)，季胺，氨基、二氨基、苯磺酸基、羧基帶有電荷的化合物靠靜電吸引到帶有電荷的吸附劑表面吸附型萃取采用極性較強(qiáng)的硅膠、硅藻土和氧化鋁等吸附劑固相萃取和HPLC相比的特點(diǎn) SPE也是一個(gè)柱色譜分離過(guò)程，分離機(jī)理、固定相和溶劑的選擇等方面與高效液相色譜（HPLC）有許多相似之處。 但是SPE柱的填料粒徑（40m）要比HPLC填料（310m）大。由于短的柱床和大的粒徑，SPE柱效比HPLC色譜柱低得多。 因此，用SPE只能分開(kāi)保留性質(zhì)有很大差別的化合物。 與HPLC

13、的另一個(gè)差別是SPE柱是一次性使用。 固相萃取操作一般有五步： 活化甲醇/乙腈 潤(rùn)濕小柱，活化填料； 平衡水或適當(dāng)緩沖液沖洗平衡小柱； 上樣將樣品轉(zhuǎn)移上柱，抽去廢液； 淋洗水或緩沖液最大程度洗去干擾物； 洗脫用小體積的溶劑將被測(cè)物質(zhì)洗脫下來(lái)并收集。親脂型鍵合硅膠SPE柱實(shí)驗(yàn)步驟平衡上樣淋洗洗脫基質(zhì)雜質(zhì)目標(biāo)化合物常見(jiàn)的固相萃取柱普通C18固相萃取固相萃取材料耐受PH范圍窄（2-7.5）硅膠鍵合吸附劑的表面存在未鍵合的硅羥基，對(duì)堿性化合物的保留較強(qiáng)，用硅膠鍵合吸附劑處理堿性化合物，回收率通常較低對(duì)極性化合物保留差HLB(Hydrophilic-lipophilic Balance Copolyme

14、r)PH1-14范圍內(nèi)穩(wěn)定無(wú)裸露的硅醇羥基親水物質(zhì)和親脂物質(zhì)具有均衡的保留能力，覆蓋了非極性、弱極性、極性化合物Oasis HLB柱（聚合物基質(zhì)）親水親脂柱的優(yōu)點(diǎn)親水基團(tuán)（吡咯烷酮基團(tuán)）和疏水基團(tuán)（二乙烯基苯）,對(duì)極性化合物和非極性化合物均有較好的保留，具有親水親脂平衡的特性具有水可潤(rùn)濕性，填料經(jīng)活化后，即使柱床干涸，吸附劑對(duì)目標(biāo)物的保留也不會(huì)發(fā)生變化有機(jī)聚合物而非硅膠，在pH 0-14 的范圍內(nèi)表現(xiàn)穩(wěn)定有機(jī)聚合物基質(zhì)的吸附劑，不存在次級(jí)相互作用，用于堿性化合物能夠得到滿意的結(jié)果Oasis HLB柱（聚合物基質(zhì)）Oasis HLB柱（聚合物基質(zhì)）離子交換與反相模式混合的固相萃取強(qiáng)陽(yáng)離子和反相雙

15、重保留基質(zhì)常用于提取凈化生物基質(zhì)中的弱堿性化合物酸性環(huán)境中含氮堿性基團(tuán)與磺酸基結(jié)合酸性藥物呈分子狀態(tài)發(fā)生反相結(jié)合作用反相作用離子交換離子交換與反相模式混合的固相萃取固相萃取法方法總結(jié)SPE優(yōu)點(diǎn)：1、不發(fā)生乳化；2、適應(yīng)的極性范圍較廣；3、提取效率高；4、方便快速；5、溶劑用量少；6、易于自動(dòng)化；7、室溫下操作，尤其適于處理?yè)]發(fā)性及對(duì)熱不穩(wěn)定的藥物。 目前，商品化固相提取小柱（cartridge）的應(yīng)用已比較普遍。最大的缺點(diǎn)： 貴 20多元/支三種方法的比較：樣本較干凈基質(zhì)效應(yīng)低操作迅速適合各種性質(zhì)化合物基質(zhì)效應(yīng)及其影響l基質(zhì)效應(yīng)（martix effect）：定義：樣品測(cè)試過(guò)程中，由于待測(cè)物以

16、外的的其它物質(zhì)存在，直接或間接影響待測(cè)物相應(yīng)的現(xiàn)象如測(cè)定血液中的紅霉素濃度為例，除了紅霉素之外的蛋白、磷脂、及其它內(nèi)源性物質(zhì)為基質(zhì)共流成分會(huì)改變待測(cè)化合物的離子化效率，引起對(duì)待測(cè)化合物監(jiān)測(cè)信號(hào)的抑制或提高基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)方法l柱后灌注法l提取后加入法（相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)）MF：基質(zhì)效應(yīng)因子MF=Set 2/Set 1IS-normalized MF :內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子Set 2: 提取空白生物基質(zhì)，濃縮復(fù)溶形成溶液，將待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)加入此溶液中。Set 1: 將待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)溶于非生物基質(zhì)的空白溶液， 如: 用甲醇、 乙腈等溶劑直接配制待測(cè)物或內(nèi)標(biāo)的溶液基質(zhì)效應(yīng)的消除（1）選擇合適的樣品預(yù)處理方法蛋白沉淀法 處理后的樣品不是很干凈、內(nèi)源性物質(zhì)較多，從而產(chǎn)生較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)液液提取法和固相萃取法處理后的樣品較潔凈，絕大多數(shù)內(nèi)源性物質(zhì)易被去除，但操作復(fù)雜，可能帶來(lái)提取回收率低其它問(wèn)題基質(zhì)效應(yīng)的消除（2）改變被測(cè)物的色譜分離條件優(yōu)化色譜條件使得待測(cè)物與內(nèi)源性雜質(zhì)分離內(nèi)源性雜質(zhì)一般極性大，反相液相中保