DNA合成原理及操作（課堂PPT）

1、.1DNA合成原理合成原理及操作規(guī)范及操作規(guī)范.2.3合成原理合成原理 DNA通過(guò)固相亞磷酰胺三酯法合成：溶液中的亞磷酰胺單體通過(guò)縮合反應(yīng)形成3-5磷酸二酯鍵，連接到固相載體（CPG或樹(shù)脂）上。并依次延伸，直到序列的最后一個(gè)5堿基連接上后合成結(jié)束。整個(gè)合成過(guò)程儀器自動(dòng)完成，每個(gè)循環(huán)分為脫保護(hù)、活化、偶合、蓋帽（封閉）、氧化五個(gè)步驟。.4第一步：脫保護(hù)（Deblocking）:用三氯乙酸（TCA）去除CPG所鏈核苷上的DMT保護(hù)基團(tuán)，暴露5羥基，供下一步縮合。第二步：活化（Activation）：?jiǎn)误w與催化劑四唑混合進(jìn)入合成柱，四唑轉(zhuǎn)移一個(gè)質(zhì)子給3亞磷酸上二異丙胺基的N原子，質(zhì)子化的氨是四唑親核

2、進(jìn)攻的離去基團(tuán)，二異丙酰胺被四唑取代，形成亞磷酰胺-四唑活性中間體。.5第三步：偶合（Coupling）:亞磷酰胺-四唑中間體與CPG所連接的核苷酸的5羥基發(fā)生縮合反應(yīng)，縮合脫掉四唑，形成延長(zhǎng)一個(gè)堿基的核苷酸鏈。第四步：蓋帽（Capping）:少量未反應(yīng)（2%）的載體上的核苷酸鏈的5羥基會(huì)在后續(xù)的循環(huán)中參加反應(yīng)，生成少一個(gè)堿基的核苷酸鏈，因此需要在反應(yīng)后進(jìn)行封閉。常用乙?；磻?yīng)與5羥基縮合成酯鍵，一般用混合乙酸酐和N-甲基咪唑等做乙?；噭?。.6第五步：氧化（Oxidation）:偶合反應(yīng)形成的三價(jià)亞磷酸酯鍵很不穩(wěn)定，因此要用氧化劑碘的四氫呋喃溶液將三價(jià)磷氧化成穩(wěn)定的五價(jià)磷。 依此步驟循環(huán)，最

3、終得到一個(gè)全長(zhǎng)DNA片段粗品。 用新鮮的濃氨水把粗品從載體上切割下來(lái)，采用適當(dāng)?shù)募兓绞饺コ唐魏桶被摫Ｗo(hù)及氰乙基脫保護(hù)形成的鹽離子。.7DNA合成作業(yè)流程合成作業(yè)流程 1. 接收訂單安排合成接收訂單安排合成 合成部根據(jù)合成實(shí)際情況合理安排訂單，依次安排加急-測(cè)序-內(nèi)部-外部，同一客戶盡量同批次安排合成，部分長(zhǎng)鏈、G含量高、合成量大的引物比較難合成，時(shí)間上可能會(huì)有所延緩 2. 上機(jī)合成上機(jī)合成 不同型號(hào)的合成儀合成通量和合成時(shí)間均不同，公司預(yù)定的儀器批次合成96條引物，20bp長(zhǎng)度合成需要2-3小時(shí)。.8 3. 氨解脫保護(hù)氨解脫保護(hù) 合成完畢后取出載體進(jìn)行切割并且脫保護(hù)。一般40bp以內(nèi)至

4、少需要2小時(shí)，鏈越長(zhǎng)需要時(shí)間越長(zhǎng)。 4. 純化純化: 目前慣用的純化方式主要有4種： OPC純化、 PAGE 純化、脫鹽純化、 HPLC純化.9 4.1 OPC純化 利用OPC柱芯對(duì)DMT寡核苷酸特殊的親和力，將不帶DMT的短片段用低濃度的有機(jī)溶劑洗脫，吸附在柱芯里的DNA用酸除去DMT后用1ml的20%乙腈洗脫。 優(yōu)點(diǎn)：方便，快捷，純化后純度可達(dá)90%，能滿足普通PCR反應(yīng)。 缺點(diǎn)：純化成功與否取決于粗品DNA的純度，合成不好的樣品可能OPC純化后也不純，并且隨著堿基數(shù)增多，純化效果降低；由于在純化過(guò)程中接觸到酸，引物容易降解。.10 4.2 PAGE 純化 利用DNA不同片段在膠中遷移率不

5、同而分離，大片段電荷多，分子大，遷移的速度慢。等目的片段與N-片段分開(kāi)后切下目的片段，80孵育2小時(shí)后脫鹽。 優(yōu)點(diǎn)：分離效果好，純度能達(dá)到98-99%，可以滿足測(cè)序、克隆等用。引物也很穩(wěn)定。 缺點(diǎn)：比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，樣品損失很大。.11 4.3 脫鹽純化 如果偶合效率高，合成效果好，粗品本身沒(méi)有什么短片段，可以直接脫鹽。 優(yōu)點(diǎn)：省去PAGE電泳的麻煩，樣品回收率高。 缺點(diǎn)：不能有效去短片段，前提一定要合成效果很好才選用此方法。.12 4.4 HPLC純化 HPLC吸附基質(zhì)分反相柱和離子柱： RP(反相柱）是根據(jù)疏水性的差別來(lái)分離的：疏水性更強(qiáng)的長(zhǎng)片段比短片段在柱內(nèi)保留的時(shí)間更長(zhǎng)。 離子柱是根據(jù)不同

6、長(zhǎng)度的寡核苷酸帶有不同的凈電荷，通過(guò)緩慢增加流動(dòng)相的離子強(qiáng)度將n-片段先洗脫。 優(yōu)點(diǎn)：純化效果好，純度可達(dá)99%以上，特別是對(duì)標(biāo)記引物，特殊探針特別有用。 缺點(diǎn)：不能批次生產(chǎn)，比較費(fèi)時(shí)，有時(shí)樣品接收不好也不能有效分離。.13 5. 樣品定量分裝樣品定量分裝 樣品純化后洗脫在1ml的20%乙腈溶液里，260紫外波長(zhǎng)下測(cè)值，根據(jù)客戶要求分裝，一般所有合成公司基本都會(huì)按1.2-1.5倍放大給量。分裝的樣品干燥，經(jīng)PAGE抽樣檢測(cè)合格后交給市場(chǎng)。.14合成時(shí)效：批次引物（按24條計(jì)算）在24小時(shí)之內(nèi)可以出貨通常合成一批20bp左右的引物：OPC純化：12小時(shí)之內(nèi) 合成2-3小時(shí) 氨解2小時(shí) OPC純化

7、（一批24條）1小時(shí)定量分裝1小時(shí) 抽干1-2小時(shí) 抽檢2小時(shí)PAGE純化：16-19小時(shí) 合成2-3小時(shí) 氨解2小時(shí) 抽干2-3小時(shí) 電泳切膠2-3小時(shí) 泡膠2小時(shí) 脫鹽0.5小時(shí) 定量分裝1小時(shí) 抽干2-3小時(shí) 抽檢2小時(shí)脫鹽純化：12-15小時(shí) 合成2-3小時(shí) 氨解2小時(shí) 抽干2-3小時(shí) 脫鹽0.5小時(shí) 定量分裝1小時(shí) 抽干2-3小時(shí) 抽檢2小時(shí).15DNA合成中堿基缺失或錯(cuò)誤原因分析一般客戶提出異議時(shí)，我們首先給客戶重新合成，然后再分析原因。 從合成機(jī)理上分析就可以很清楚的表明：人為的因素不可能造成堿基缺失或個(gè)別的堿基錯(cuò)誤。如果說(shuō)某一個(gè)堿基由于種種原因(如瓶中溶液沒(méi)有了，或管道堵塞)，

8、未加入到正在延伸的Oligo上，那么下一個(gè)反應(yīng)Capping將會(huì)把Oligo封死，使整個(gè)oligo合成立即中止 。造成的原因可能是：1、Taq酶的原因。因?yàn)樵赑CR擴(kuò)增時(shí)引物也被擴(kuò)增,就可能出現(xiàn)錯(cuò)誤 ，2、化學(xué)原因 。在合成過(guò)程中，如果本公司提供的DNA合成報(bào)告單是正確的，表示合成是成功的 。化學(xué)合成的DNA片段要比天然的DNA片段有更多的堿基突變概率。但其真正的化學(xué)機(jī)理還不太清楚，但可以肯定的是要保證100不發(fā)生錯(cuò)誤是不可能的。解決的辦法：1、采用高保真的 Taq酶2、重新挑克隆3、重合引物.16DNA損傷一、堿基脫落形成AP位點(diǎn)熱和酸等都可使嘌呤和嘧啶從DNA鏈的核糖磷酸骨架上脫落，形成A

9、P位點(diǎn)（Apurinic orApyrimidinic site ）。烷化鳥(niǎo)嘌呤的糖苷鍵不穩(wěn)定，容易脫落形成DNA上無(wú)堿基的位點(diǎn)。二、堿基的改變物理因素：電離輻射可引起其它物質(zhì)產(chǎn)生自由基，從而引起堿基氧化修飾、過(guò)氧化物的形成、堿基環(huán)的破壞和脫落等。一般嘧啶比嘌呤更敏感。化學(xué)因素a. 烷化劑硫酸二甲酯、甲烷磺酸甲酯（MMS）等烷化劑可將烷基加到嘌呤或嘧啶的N或O上使堿基烷基化。鳥(niǎo)嘌呤的N7和腺嘌呤的N3最容易受攻擊，形成m7G和m3A烷基化的嘌呤堿基，導(dǎo)致復(fù)制時(shí)堿基錯(cuò)配。例如鳥(niǎo)嘌呤N7被烷化后會(huì)與T配對(duì)，結(jié)果會(huì)使G-C轉(zhuǎn)變成A-T。b. 堿基類似物5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氟尿嘧啶（5-FU

10、）、2-氨基腺嘌呤（2-AP）等。它們的結(jié)構(gòu)與堿基相似，進(jìn)入細(xì)胞能替代正常的堿基參入到DNA鏈中而干擾DNA復(fù)制合成。如5-BU與T結(jié)構(gòu)相似，在酮式結(jié)構(gòu)時(shí)與A配對(duì)；它更易成為烯醇式結(jié)構(gòu)與G配對(duì)，在DNA復(fù)制時(shí)導(dǎo)致A-T轉(zhuǎn)換為G-C。 .17c. 黃曲霉素黃曲霉素B、1,2-乙酰-氨基芴、苯并芘、吖啶等可插入堿基序列，引起移碼。 d. 硝酸鹽亞硝酸鹽能使C脫氨變成U，經(jīng)過(guò)復(fù)制就可使DNA上的G-C變成A-T對(duì)。堿基的自發(fā)改變和損傷a. 堿基的異構(gòu)互變4種堿基各自的異構(gòu)體間都可自發(fā)地互變（烯醇式與酮式間的互變），這會(huì)使堿基間發(fā)生錯(cuò)配，使A-C、T-G等。b. 堿基的脫氨基作用堿基的環(huán)外NH2有時(shí)會(huì)

11、自發(fā)脫落，使CU、A次黃嘌呤（I）、G黃嘌呤（X）等，DNA復(fù)制時(shí)，U-A、I-X、I-C配對(duì)，導(dǎo)致子代DNA序列錯(cuò)誤。5-甲基胞嘧啶脫氨基產(chǎn)生T（引起C-GT-A的變化），而C脫氨基產(chǎn)生U（它通常被移出或被C代替）。 氧自由基傷害細(xì)胞代謝副產(chǎn)物O2-、H2O2等會(huì)造成堿基損傷，產(chǎn)生胸腺嘧啶乙二醇、羥甲基尿嘧啶等堿基修飾物，引起堿基配對(duì)錯(cuò)誤。.18三、 堿基插入或缺失吖啶類分子帶正電呈扁平狀，易于嵌入DNA堿基平面間，導(dǎo)致在復(fù)制或重組過(guò)程中缺失或插入一個(gè)堿基。DNA聚合酶在復(fù)制過(guò)程中發(fā)生滑動(dòng)，尤其在連續(xù)幾個(gè)相同堿基的區(qū)段產(chǎn)生1個(gè)或幾個(gè)堿基的缺失或插入。聚合酶在模板鏈上滑動(dòng)易于造成缺失，在生長(zhǎng)鏈上滑動(dòng)易于造成插入。插入或缺失會(huì)導(dǎo)致讀碼框改變。.19四、 嘧啶二聚體DNA受到紫外線照射時(shí)，使DNA鏈上相鄰的嘧啶以共