期末考試論文格式及參考模板

1、論文格式 要求 一、頁面設(shè)置紙型：A4紙型上下邊界：25mm左右邊界：25mm行距：固定值24磅字體：宋體字號：標(biāo)題四號加粗，正文五號頁碼：暫不設(shè)置頁碼二、論文格式*（中文題目，一般不超過20個字）院系名稱（小四號黑體） 作者姓名（小四號楷體）指導(dǎo)老師的姓名和職稱：請在學(xué)生作者的署名下方另起一行注明。 摘要（五號黑體）：*（中文，五號仿宋。摘要是科研論文主要內(nèi)容的簡短、扼要的重述，必須表達(dá)論文本身新的、最具特色的內(nèi)容，重點是結(jié)果和結(jié)論；.一般以第三人稱的語氣寫，避免用“本文”、“我們”、“本研究”等作為文摘的開頭。） 關(guān)鍵詞（五號黑體）：*（中文，五號仿宋，一般選取38個詞，每個詞之間應(yīng)留有空

2、格以區(qū)別之。）正文（五號宋*說明：文內(nèi)必要的解釋性說明詞語可采用“注釋”形式，其序碼以圓括號放在加注處右上角，內(nèi)容排在加注處所在頁的頁下，頁下注序碼每頁單獨排序。表格設(shè)計必須清晰、規(guī)范，每個表格除有欄頭、表身外還應(yīng)在表的上方居中標(biāo)明表序和表題，中間空一格將兩者分開；表隨文放，一般應(yīng)列在“見表×”文字的自然段落的下面，在正文中要明確提及見表×；表格一般采用三線表。插圖要求大小比例適中，數(shù)字清晰，照片黑白對比分明；圖也應(yīng)隨文字放在“見圖×”文字的自然段落下面；每幅圖都要有圖序和圖題，通常寫在圖的下方居中位置。論文內(nèi)各大部分標(biāo)題用“一、二”，次級標(biāo)題為“（一）、（二）”

3、，三級標(biāo)題用“1、2”，四級標(biāo)題用“（1）、（2）”。不再使用五級以下標(biāo)題。 參考文獻(xiàn)（黑體五號，在正文后居中排版）參考文獻(xiàn)是期刊時為序號著者.題名J.期刊名，出版年份，卷號(期號):頁碼.參考文獻(xiàn)是圖書時為序號著者.書名M.版次.出版地:出版社,出版年份.頁碼.*（英文題目，小四號 Times New Roman） Abstract:* Key Words: *； *； *附：醫(yī)科論文格式樣板參照人纖溶酶原K5基因與真核表達(dá)載體pPICZaA重組體的構(gòu)建光華口腔學(xué)院 陳素潔指導(dǎo)教師 蔡衛(wèi)斌 高國全摘要: 以K5/pET22b（+）為模板用PCR的方法擴(kuò)增人纖溶酶原kringle5基因，并用X

4、ba I和EcoR I雙酶切目的基因和真核表達(dá)載體pPICZaA，膠回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物，用DNA T4連接酶連接目的基因和載體構(gòu)建重組體K5/pPICZaA，并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5a，篩選陽性菌落，PCR鑒定重組體K5/pPICZaA，為人纖溶酶原K5在真核系統(tǒng)中表達(dá)提供基礎(chǔ)性研究。關(guān)鍵詞: 人纖溶酶原; kringle結(jié)構(gòu); 基因克隆新生血管的生成為惡性腫瘤生長提供營養(yǎng)，也是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的必要條件，抑制新生血管在一定程度上可以減緩腫瘤細(xì)胞的惡性擴(kuò)增，因此，基于抑制血管生成的治療成為腫瘤治療的熱點。1994 年, OReilly 等人從荷瘤小鼠的尿液和血清中分離純化得到血管生成抑制素(an

5、giostatin) , 它與人纖溶酶原kringle14 功能區(qū)有同源性, 具有抑制毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、抑制血管生成和轉(zhuǎn)移瘤生長的生物活性1 。動物試驗研究還表明, 血管生成抑制素對纖維肉瘤細(xì)胞株、人乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌細(xì)胞株在小鼠體內(nèi)形成的腫瘤也有很強(qiáng)的抑制作用2 。最近, Gao 等3發(fā)現(xiàn)人纖溶酶原的kringle5 功能區(qū)有比angiostatin 更強(qiáng)的抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長的活性。本課題在已獲得原核體系中表達(dá)的活性K5蛋白基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu)建K5/pPICZaA重組體，以期在真核表達(dá)體系中獲得有活性K5蛋白。一、材料和方法（一）材料 含K5/pET22b（+）重組體的E.coli B

6、L21(DE3)為本室構(gòu)建并保存；EcoR I 和Xba I為New England公司產(chǎn)品；酵母粉、胰蛋白胨為OXIOD公司產(chǎn)品；IPTG購自北京鼎國生物技術(shù)公司；抗生素zeocin為Sigma公司產(chǎn)品，pfu Tag DNA聚合酶和質(zhì)粒pPICZaA均購自invitrogen公司，DNA膠回收試劑盒購自NOVAGEN公司，其他試劑為分析純；引物由賽百盛公司合成。（二）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增K5基因 以K5/pET22b（+）重組體為模板，上游引物為：5-CGAATTCCCAGATGTAGAGACTCCTTC-3，5端設(shè)計有EcoRI的酶切位點；下游引物為：5-CTCTAGAGCGGCA

7、CACTGAGGGACATCACA-3，5端設(shè)計有Xba I的酶切位點，建立PCR反應(yīng)體系：ddH2O 38ml，10´pfu Buffer 5ml，4´dNTPs 4ml，K5 primer(+) 0.7ml，K5 primer(-) 0.8ml，K5/pET22b（+）1ml，pfu Tag DNA聚合酶0.5ml。混勻后，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95預(yù)變性3m，95變性80s，54復(fù)性100s，72延伸2m，循環(huán)30次，72延伸10m。擴(kuò)增完畢后，取樣5ml，于1.0%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，檢測是否有擴(kuò)增產(chǎn)物K5基因。（三）K5基因和載體的酶切及酶切產(chǎn)物的純化 P

8、CR產(chǎn)物K5 DNA片段經(jīng)酚/氯仿抽提、乙醇沉淀純化后，用EcoR I 和Xba I兩種酶同時消化，質(zhì)粒pPICZaA同樣用EcoR I與Not I進(jìn)行雙酶切，雙酶切體系組成：ddH2O 39.5ml，10´Buffer 5ml，100´BSA 0.5ml, DNA 2mg , EcoRI 1.0ml, XbaI 1.0ml，總體積50ml。酶切產(chǎn)物按照DNA膠回收試劑盒操作方法進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用Genegenuis凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行DNA相對定量。（四）重組體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 純化后的產(chǎn)物在T4 DNA 連接酶作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系：K5

9、 DNA 8ml，pPICZaA 1.0ml，Buffer 2.0ml，T4 DNA Ligase 1.5ml，ddH2O 6.5ml，總體積20ml。反應(yīng)液于16水浴反應(yīng)18小時，置于4待轉(zhuǎn)化。然后導(dǎo)入感受態(tài)的大腸桿菌DH5a（感受態(tài)細(xì)胞的制備參見分子克?。坎加诤?5mg/ml zeocin抗生素的LB板上，37過夜培養(yǎng)。 （五）陽性菌落的篩選及鑒定 挑取LB平板上單克隆菌落，接種于無菌含25mg/ml zeocin的LB培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)。參照分子克隆中質(zhì)粒DNA提取方法抽提培養(yǎng)物的質(zhì)粒DNA，TE溶解DNA，于-20 保存。以抽提DNA為模板，引物和PCR體系同前，鑒定菌落DNA中是否

10、存在目的基因，初步判定重組體構(gòu)建成功與否。二、實驗結(jié)果（一）PCR反應(yīng)獲得目的基因K5片段 通過PCR反應(yīng)獲得K5基因片段，1.0%瓊脂糖凝膠電泳示目的基因大小約為288bp（如圖1所示，含設(shè)計的雙酶識別序列），與理論推測的基因片段大小一致。M7654321100bp289bp1038bp900bp800bp700bp600bp500bp400bp300bp200bp 圖1. PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因17：PCR擴(kuò)增的目的基因片段；M：標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA片段（二）K5基因和pPICZaA載體雙酶切產(chǎn)物的純化和定量 目的基因K5和載體pPICZaA經(jīng)EcoR I 和Xba I消化后，用1.0%的瓊脂

11、糖凝膠電泳和膠回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物（如圖2A），并電泳鑒定純化后的產(chǎn)物，Genegenius凝膠分析系統(tǒng)對DNA進(jìn)行相對定量示：K5 為14.7ng/ml, pPiczaA為29.4 ng/ml。5M43121038bp900bp800bp600bp700bp500bp100bp400bp300bp200bpBA 圖2. 目的基因與載體雙酶切及酶切產(chǎn)物純化與相對定量A：酶切前后；B：酶切產(chǎn)物純化后鑒定；1：酶切前載體pPICZaA；2：酶切后PCR產(chǎn)物；3：酶切后載體pPICZaA；4：PCR酶切產(chǎn)物純化后；5：載體酶切產(chǎn)物純化后；M：標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA片段（三）PCR鑒定陽性菌落 轉(zhuǎn)化菌接種

12、含有25mg/ml zeocin的LB平板后，有單克隆菌落產(chǎn)生，挑取菌落擴(kuò)增培養(yǎng)抽提質(zhì)粒DNA，以其為模板PCR鑒定含重組體菌落（如圖3）：從重組菌質(zhì)粒DNA中能擴(kuò)增出目的基因片段，大小與從陽性K5/pET22b（+）擴(kuò)增出的目的基因相一致，而以空載體為模板則不能擴(kuò)增出目的片段。123M100bp300bp500bp700bp目的基因14.4kD圖3.SDS-PAGE分析重組轉(zhuǎn)化菌株表達(dá)產(chǎn)物1：陽性模板K5/pET22b（+）擴(kuò)增產(chǎn)物；2：重組菌質(zhì)粒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物；3：質(zhì)粒pPICZaA擴(kuò)增產(chǎn)物；M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)三、討論人纖溶酶原kringle5 功能區(qū)具有抑制毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖 、遷移

13、的作用3，4, 這是血管形成過程的兩個關(guān)鍵步驟，推測人纖溶酶原kringle5 功能區(qū)可能具有抑制血管形成和腫瘤生長的特性。本課題組已獲得從原核體系中表達(dá)的活性K5蛋白，但對其活性是否受細(xì)菌內(nèi)毒素的影響及其天然構(gòu)象是否發(fā)生改變尚不清楚。本實驗是前期工作的基礎(chǔ)上，構(gòu)建K5與真核表達(dá)載體pPICZaA的重組體，為下一步的K5真核表達(dá)體系的建立提供給出行研究。人纖溶酶原的Kringle 5功能區(qū)約由91個氨基酸組成，編碼該蛋白的基因約有289bp。本實驗首先用PCR的方法從K5/pET22b（+）擴(kuò)增出目的基因，其大小理論推算一致。目的基因和載體pPICZaA均用EcoR和XbaI兩限制性核酸內(nèi)切酶

14、酶切，產(chǎn)物純化后進(jìn)行連接反應(yīng)，并轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌DH5a，挑選單克隆菌落，PCR方法能從重組菌中擴(kuò)增出目的基因片段，初步鑒定了K5/pPICZaA重組體，為后續(xù)工作提供基礎(chǔ)。參 考 文 獻(xiàn)1 Oreillym S, Holmgren L, Shing Y, et al. Angiostatin:a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma J . Cell , 1994, 79: 315-328.2 Oreillym S , Holmgren

15、L, Chen C, et al. Angiostatin induces and sustains dormancy of human primary tumors in mice J . Nat Med, 1996, 2: 689-692.3 Zhang D, Kaufman PL, Gao G（高國全）, et al. Intravitreal injection of plasminogen kringle 5, an endogenous angiogenic inhibitor, arrests retinal neovascularization in rats. Diabeto

16、logia 2001 Jun;44(6):757-65. 4 Gao G（高國全）, Li Y, Gee S, et al. Down-regulation of vascular endothelial growth factor and up-regulation of pigment epithelium-derived factor: a possible mechanism for the anti-angiogenic activity of plasminogen kringle 5. J Biol Chem 2002 Mar 15;277 (11):9492-7. Constr

17、uction of the Recombinant of Plasminogen Kringle 5 and pPICZaA Abstract : The gene encoding kringle 5 of human plasminogen was amplified from the template of K5/pET22b（+）by polymerase chain reaction. The K5 gene fragment and the vector of pPICZaA were digested by Xba I and EcoR I. The product of dig

18、estion was purified by gel purification kit and ligated by T4 DNA ligase to construct the recombinant of K5/pPICZaA. Then the recombinant was transducted into E.coli of DH5a and cultured overnight. The colony was screened by the antibiotic of zeocin and identified by polymerase chain reaction.Keywor

19、ds : human plasminogen；kringle5 domain；gene cloning；FoxP3的研究新進(jìn)展中山醫(yī)學(xué)院 張良明指導(dǎo)老師彭輝摘要： FoxP3是一個轉(zhuǎn)錄因子，它和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)育和功能密切相關(guān)。 FoxP3表達(dá)過多或者過少都會影響到機(jī)體中免疫系統(tǒng)，F(xiàn)oxP3基因的突變更會引起嚴(yán)重的自身免疫病。對FoxP3的深入研究將有助于了解機(jī)體免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，對于腫瘤治療，自身免疫病治療，誘導(dǎo)移植物耐受等方面將大有好處。關(guān)鍵詞：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；CD4 + CD25 + 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；免疫調(diào)節(jié)；免疫耐受 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是T細(xì)胞的一種，它們有控制免疫應(yīng)答反應(yīng)和誘導(dǎo)免疫耐受

20、的功能。這些Treg在許多實驗?zāi)Ｐ屠锒家呀?jīng)得到證實，一般是CD4+ T細(xì)胞，并且相當(dāng)部分是表達(dá)CD25分子(IL-2 受體a鏈)，包括自然產(chǎn)生的(在胸腺里自然發(fā)育成熟的)和在外周血中的T細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的等。最近的研究表明Treg的功能相當(dāng)廣泛，它們幾乎涉足所有的免疫反應(yīng)，包括過敏癥，感染，炎癥，移植物排斥反應(yīng)和腫瘤免疫等。另外，最近研究在早產(chǎn)嬰兒的臍帶血中CD25+ CD4+ Treg的減少規(guī)律這個實驗還表明Treg在先天性免疫方面也發(fā)揮著重要的功能1。 FoxP3是一個轉(zhuǎn)錄因子，它和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)育和功能密切相關(guān)。下面就談?wù)勀壳癋oxP3的研究進(jìn)展情況。一、FoxP3的發(fā)現(xiàn)以及定位轉(zhuǎn)錄因子

21、是一些多結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，常根據(jù)其結(jié)合DNA的保守區(qū)域來分類。forhead區(qū)域第一次被證實是作為一個和老鼠肝細(xì)胞核因子3相同的果蠅melanogaster轉(zhuǎn)錄因子forkhead2。forkhead區(qū)域包含一段110bp的DNA結(jié)合的保守區(qū)域，它能通過特異性結(jié)合DNA而調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)。各種forkhead家族的轉(zhuǎn)錄因子在多種發(fā)育過程起重要作用，例如信號的傳導(dǎo)，細(xì)胞的分化和發(fā)育等。FoxP3轉(zhuǎn)錄因子就是該家族的成員之一， 它是在科學(xué)家在研究IPEX(The immune dysregulation， polyendocrinopathy， enteropathy， X-linked synd

22、rome)時發(fā)現(xiàn)的，定位在X染色體上Xp11.23-Xq13.3 3。二、FoxP3表達(dá)的細(xì)胞 Hori S 和Sakaguchi S等人已經(jīng)證實FoxP3是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)育和功能的關(guān)鍵性基因，它主要在CD4+CD25+T細(xì)胞表達(dá)4。在老鼠和人上，胸腺和外周來源的CD4+CD25+T細(xì)胞都高表達(dá)FoxP3 mRNA ，特別是胸腺來源的。通過分析基因組的表達(dá)，Bruder D 等人發(fā)現(xiàn)Neuropilin-1(Nrp1)是CD4+CD25+T細(xì)胞表面的特異性標(biāo)志物，Nrp1高表達(dá)的T細(xì)胞也高表達(dá)FoxP3 mRNA，同時有抑制CD4+CD25-T細(xì)胞的功能5。 雖然使外周血中的 CD4+CD25

23、- 細(xì)胞變成CD4+CD25+細(xì)胞的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，但最近的研究表明IL-2 和 TGF-beta 通過作用CD4+CD25-細(xì)胞，然后，后者與CD25+ CD4+ 細(xì)胞接觸而使其變成CD4+CD25+細(xì)胞，轉(zhuǎn)變后的細(xì)胞表面表達(dá)FoxP3，具有抑制功能6。 研究表明TGFbetal能夠刺激CD4+CD25+ T-cells表達(dá)FoxP3，并且FoxP3的表達(dá)的量會隨著TGFbetal的減少而減少7。 在日本的Takahata Y等人研究早產(chǎn)兒和新生兒的臍帶血的實驗中發(fā)現(xiàn)，早產(chǎn)兒臍帶血中含有高比例的CD4+CD25+ T 細(xì)胞 ，而這個高比例會隨著胎兒的生長而趨向一個正常成人的水平，胎兒臍

24、帶血中的CD4+CD25+ T 細(xì)胞也表達(dá)FoxP3，有抑制功能，這表明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在人發(fā)育早期就出現(xiàn)的，而且發(fā)揮著調(diào)節(jié)免疫的功能8。 FoxP3在CD4+CD25-T細(xì)胞也可以低表達(dá)，但是其功能還有待進(jìn)一步研究來確定。 總之，到目前的研究表明FoxP3基因主要在CD4+CD25+T細(xì)胞上表達(dá)， 是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)育和功能的關(guān)鍵性的基因。三、FoxP3表達(dá)的產(chǎn)物以及其對自然發(fā)生的Treg的作用 以上的研究都表明FoxP3與Treg的發(fā)育與功能有極大的關(guān)系，那究竟它們是怎樣的關(guān)系呢? FoxP3是在X染色體上的一段基因，是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面最特異的標(biāo)志，與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)育和功能有重要的關(guān)系9。Fo

25、xP3表達(dá)過多或者過少都會直接影響到T細(xì)胞的生長發(fā)育，甚至引發(fā)免疫性疾病。人們發(fā)現(xiàn)FoxP3的表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物是scurfin，F(xiàn)oxP3有突變的老鼠會因為CD4+T細(xì)胞的高反應(yīng)性而得嚴(yán)重的像自身反應(yīng)性的疾病，相反大量表達(dá)scurfin的老鼠，就會導(dǎo)致身體內(nèi)的成熟T細(xì)胞含量比正常老鼠的要少，而且經(jīng)過分析其體內(nèi)B細(xì)胞與TD-Ag的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)血清中的特異性Ab的量減少和脾功能結(jié)構(gòu)的混亂10。這其中的原因是過度表達(dá)scurfin使CD4+T細(xì)胞發(fā)育有缺陷，從而在依賴T細(xì)胞的Ab反應(yīng)中不能夠提供幫助給B細(xì)胞，所以血清中的特異性Ab就少了。 在荷蘭學(xué)者研究先天性青少年關(guān)節(jié)炎(juvenile idiop

26、athic arthritis (JIA)試驗中，發(fā)現(xiàn)預(yù)后良好的關(guān)節(jié)炎患者比預(yù)后差的患者體內(nèi)外周血中的CD4(+)CD25(bright) FoxP3(+)T 細(xì)胞表達(dá)的量明顯要多，在關(guān)節(jié)滑液的分析結(jié)果也顯示預(yù)后良好型CD4+CD25+ T 細(xì)胞的總量相比較多11。這些研究都表明FoxP3能夠調(diào)節(jié)Treg的生長發(fā)育，誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受，減少自身反應(yīng)性疾病的發(fā)生。 另外，F(xiàn)oxP3在其它細(xì)胞上也可以表達(dá)，而且也能夠發(fā)揮免疫抑制功能。 最近研究表明體外產(chǎn)生的同種抗原特異性的CD8+ CD28- T抑制性細(xì)胞也表達(dá)FoxP3，它們與人類內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，使其表達(dá)抑制性受體支持分子和下調(diào)相互刺激的功能，

27、導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的耐受12。 FoxP3在腫瘤細(xì)胞也有表達(dá)，最近日本的研究者發(fā)現(xiàn)成人T細(xì)胞白血病淋巴瘤(Adult T-cell leukaemia/lymphoma (ATLL)的瘤細(xì)胞也表達(dá)FoxP3，只不過表達(dá)的量比正常的少，這表明這些瘤細(xì)胞也有一定的調(diào)節(jié)功能13。四、FoxP3作用的分子機(jī)制以及其誘導(dǎo)機(jī)制既然FoxP3與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)育和功能有這么多的聯(lián)系，下面就談?wù)凢oxP3的作用機(jī)制以及FoxP3是怎樣誘導(dǎo)產(chǎn)生的。關(guān)于FoxP3的作用機(jī)制到目前為止還不是很清楚，但是此前的一些研究可以推測其機(jī)制可能與IL-2有關(guān)。FoxP3是一個轉(zhuǎn)錄因子，能夠通過結(jié)合到DNA上，調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)。H

28、ori和sakaguchi研究表明轉(zhuǎn)導(dǎo)了FoxP3的初始T細(xì)胞，它們的IL-2，IL-4和IFN-gamma的表達(dá)會被抑制14。早在2001年，就有人發(fā)現(xiàn)FoxP3的結(jié)合到DNA上的位點是在IL-2增強(qiáng)子附近的NFAT(nuclear factor of activated T cells)調(diào)節(jié)位點上，這樣FoxP3就可以通過結(jié)合NFAT來抑制IL-2的增強(qiáng)子的活性，達(dá)到抑制IL-2的產(chǎn)生15。這也同樣解析了表達(dá)FoxP3的CD4+CD25+ T 細(xì)胞不表達(dá)IL-2了。FoxP3作為一個轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到DNA上，它有抑制的功能，但它也可能充當(dāng)一個轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子的角色。CD25，GITR，CTLA

29、-4和CD103等是Treg表面重要的標(biāo)志性分子，和其調(diào)節(jié)功能有重要聯(lián)系。有研究表明轉(zhuǎn)導(dǎo)了FoxP3的T細(xì)胞能夠多表達(dá)以上這些表面分子14。IL-10是一個負(fù)調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子，通過誘導(dǎo)FoxP3可以誘導(dǎo)IL-10的產(chǎn)生分泌15。至于FoxP3是直接還是間接作用于基因而促進(jìn)這些分子的表達(dá)，目前還不是很清楚。同樣，F(xiàn)oxP3這個轉(zhuǎn)錄因子是直接還是間接調(diào)節(jié)Treg的發(fā)育和功能，目前也有待研究。雖然FoxP3作用機(jī)制還不是很清楚，但是其免疫調(diào)節(jié)功能是無容質(zhì)疑的，因此，人們千方百計地誘導(dǎo)它的表達(dá)。我們知道在胸腺中高親和的TCR相互作用對CD4+CD25+ T 細(xì)胞的發(fā)育有重要的作用， 那么FoxP3的表達(dá)

30、與T細(xì)胞受體(TCR)有沒有關(guān)系呢?為了確定它們的關(guān)系，研究者從無反應(yīng)性的TCR轉(zhuǎn)基因小鼠分離出CD4+CD25- T 細(xì)胞，然后用該轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因編碼的同類的配體(高親和性的自身MHC分子復(fù)合物)去刺激它們，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)FoxP3，雖然沒有自然產(chǎn)生的CD4+CD25+ T 細(xì)胞產(chǎn)生的量多，但是這足以提示TCR的作用可以誘導(dǎo)FoxP3的表達(dá)16。胸腺產(chǎn)生的CD4+CD25+ T 細(xì)胞的FoxP3表達(dá)與TCR的作用有關(guān)，那么外周血中的CD4+ T 細(xì)胞 FoxP3的表達(dá)與什么有關(guān)呢?人們研究發(fā)現(xiàn)TGF-beta與體內(nèi)的FoxP3的表達(dá)有關(guān)。CD4+CD25+ T 細(xì)胞會隨著TGF-beta增加而提高表

31、達(dá)的量，同樣，當(dāng)TGF-beta刺激的信號減弱時，F(xiàn)oxP3表達(dá)的量也會減少7。最近的研究發(fā)現(xiàn)TGF-beta和IL-10一起作用目標(biāo)細(xì)胞CD4+CD25- T 細(xì)胞，后者在通過與CD4+CD25+ T 細(xì)胞接觸作用，使其轉(zhuǎn)變成為CD25+細(xì)胞，表達(dá)FoxP3，具有抑制的功能17。另外，最近又有研究表明依靠TGF-beta能夠在CD4 Ab被封閉后重新誘導(dǎo)移植耐受，誘導(dǎo)產(chǎn)生的表達(dá)FoxP3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞會在移植物聚集，發(fā)生抑制作用，延長移植物的生存時間18。這些研究都表明， TGF-beta就能夠促進(jìn)FoxP3的表達(dá)，誘導(dǎo)Treg的產(chǎn)生，但是TGF-beta究竟是怎樣作用的還有待進(jìn)一步的研究。五

32、、FoxP3的表達(dá)與疾病FoxP3基因的表達(dá)與很多疾病有關(guān)，下面從幾個方面談?wù)勊鼈兊年P(guān)系。（一）FoxP3與自身反應(yīng)性免疫病的關(guān)系FoxP3與多種自身反應(yīng)性疾病有關(guān)。其致病作用主要是FoxP3影響Treg的功能而致病。最早發(fā)現(xiàn)與其有關(guān)的是IPEX(the immunodysregulation， polyendocrinopathy， enteropathy syndrome)，這是一種和X染色體有關(guān)的隱性遺傳病，主要由免疫調(diào)節(jié)功能混亂引起的自身免疫病，這個疾病的基因就是FoxP3，正是FoxP3基因的突變使Treg的量減少，對自身反應(yīng)性T細(xì)胞的抑制作用減少了而致病3。與此相反，在研究風(fēng)濕性關(guān)

33、節(jié)炎過程中，人們用dnaJP1(一種可以誘導(dǎo)未經(jīng)治療的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)的前炎癥T細(xì)胞反應(yīng)的多肽)可以引起CD4+CD25+ T cell表達(dá)FoxP3，引起耐受，這樣就可以減輕關(guān)節(jié)炎19。在與糖尿病的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)TGF-beta在糖尿病的早期能夠通過促進(jìn)CD4+CD25+ T cell的生長發(fā)育從而抑制疾病的發(fā)生20。令人注意的是I型糖尿病雖然是自身免疫性疾病，但是最近意大利的研究者在研究撒丁島糖尿病人的FoxP3基因時，發(fā)現(xiàn)I型糖尿病與FoxP3基因的變化并沒有太大的關(guān)系21?？傊煤肍oxP3來誘導(dǎo)免疫耐受，對于治療自身反應(yīng)性疾病大有好處。（二）FoxP3與腫瘤免疫腫瘤治療難

34、與機(jī)體的免疫系統(tǒng)無法清除腫瘤細(xì)胞有重要關(guān)系，這其中機(jī)體對腫瘤的耐受又是主要原因。研究者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤（metastatic melanoma）淋巴結(jié)中表達(dá)FoxP3的CD4+CD25+ T細(xì)胞是沒有發(fā)生腫瘤的淋巴結(jié)和外周血單個核細(xì)胞(PBMC)表達(dá)的量的兩倍22。研究者在體外實驗，這些細(xì)胞有抑制的功能，能夠抑制CD4+CD25- T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的增殖，還可以通過接觸抑制的方式抑制IL-2和IFN-gamma的釋放， 這些都不利于治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，如果能夠想辦法減少體內(nèi)的Treg，將大大有利于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的治療。（三） 其它在HIV患者體內(nèi)存在高水平的激活的T細(xì)胞，但是FoxP3

35、并沒有能夠促進(jìn)足夠多的記憶性T細(xì)胞發(fā)展為Treg，研究者發(fā)現(xiàn)一部分HIV患者體FoxP3+CD4+CD25+ T細(xì)胞的水平已經(jīng)大大的降低了。降低Treg的比例，提高激活的T細(xì)胞的比例，這樣此消彼長，就會加重病情的進(jìn)展23。另外，法國的研究者發(fā)現(xiàn)從HIV患者外周血中分離的CD4+CD25+ T細(xì)胞表達(dá)了一種記憶的顯形，但是，與CD4+CD25- T細(xì)胞不同的是對于有記憶的抗原和p24的刺激， 這些CD4+CD25+ T細(xì)胞并沒有增殖。CD4+T細(xì)胞對于結(jié)核菌素，CMV和p24的刺激只有在CD4+CD25+ T細(xì)胞的減少的情況下才能增殖24。所有這些將會誘導(dǎo)機(jī)體對HIV耐受的產(chǎn)生，加重病情的發(fā)展。

36、另外，在移植中如果能夠利用FoxP3來誘導(dǎo)機(jī)體對移植物的耐受，將會大大提高移植物的生存時間。六、結(jié) 語FoxP3是一個與Treg的發(fā)育與功能有重要關(guān)系的轉(zhuǎn)錄因子，目前尚有許多問題有待進(jìn)一步研究，對該轉(zhuǎn)錄因子的深入研究將有助于對機(jī)體免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的了解以及對自身免疫性疾病、腫瘤、移植排斥等的病理、生理機(jī)制的認(rèn)識，并為臨床這些疾病的免疫治療提供新的途徑。參考文獻(xiàn)1 Xystrakis E, Dejean AS, Bernard I, Druet P, Liblau R, Gonzalez-Dunia D,Saoudi A. Identification of a novel natural regu

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56、toimmune disease.The further research to FoxP3 may show us the mechanism of the immune regulation and a new way for tumor therapy and autoimmune disease.In addition,FoxP3 will be exploited to induce transplantation tolerance.Key Words: FoxP3;CD4 + CD25 + T cells;immune regulation;immune toleranceSARS冠狀病毒TW1多聚酶putative nsp3片段的克隆、鑒定中山醫(yī)學(xué)院 李惠君 林莉 王林琳 李娟 古燦基 指導(dǎo)老師：陸家海摘要：背景：SARS相關(guān)冠狀病毒是引起人嚴(yán)重急性呼吸綜合征的病原體。目前國內(nèi)外大部分對SARS-CoV的研究主要仍集中于其結(jié)構(gòu)蛋白S、M、N和E，而對其酶系統(tǒng)的認(rèn)識還十分貧乏。研究SARS-CoV多聚酶有助于了