分子基本操作技術(shù)

1、從20世紀(jì)中葉開始，分子生物學(xué)研究得到高速發(fā)展，主要原因之一是研究方法，特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步。基因操作主要包括DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因人工合成、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等，是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)。 基因組 DNA 提取技術(shù) 凝膠電泳技術(shù) 一、常規(guī)電泳 瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳 二、脈沖凝膠電泳第一節(jié)第一節(jié) 凝膠電泳技術(shù)凝膠電泳技術(shù)3一、常規(guī)電泳一、常規(guī)電泳自從瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段，也是

2、現(xiàn)在通用的許多分子生物學(xué)研究方法，如：DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性內(nèi)切酶片段分析以及限制酶切作圖等的技術(shù)基礎(chǔ)，受到科學(xué)界的高度重視?；驹恚荷锎蠓肿釉谝欢╬H條件下，通常會帶電荷。將其放置到電場中，就會以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。分子在電場作用下的遷移速度，與電場強(qiáng)度和電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與分子的摩擦系數(shù)成反比。摩擦系數(shù)是分子大小、極性及介質(zhì)粘度的函數(shù)。根據(jù)分子大小、構(gòu)型或形狀的差異和帶凈電荷數(shù)，可通過電泳將蛋白質(zhì)或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離。4 在生理?xiàng)l件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)，是呈離子化狀態(tài)的，所以，DNA和RNA多核苷酸鏈又被稱為多聚陰

3、離子（polyanions），把這些核酸分子放置在電場當(dāng)中，它們就會向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。這就是應(yīng)用凝膠電泳技術(shù)分離DNA片段的基本原理。大分子量的DNA移動的慢小分子量的DNA移動的快電泳緩沖液陽極陰極DNA加樣孔51、瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳是一種簡便、快速、最常用的分離純化和鑒定核酸的方法 瓊脂糖是從海藻中提取的一種線狀高聚物 根據(jù)瓊?cè)芙鉁囟?，把瓊脂糖分為一般瓊脂糖和低熔點(diǎn)

4、瓊脂糖 低熔點(diǎn)瓊脂糖熔點(diǎn)為6265，溶解后在37下維持液體狀態(tài)約數(shù)小時(shí)，主要用于DNA片段的回收，質(zhì)粒與外源性DNA的快速連接等61 1）凝膠濃度選擇）凝膠濃度選擇瓊脂糖濃瓊脂糖濃度度(%)線型線型DNA分子的分分子的分離范圍離范圍(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.2312.00.12瓊脂糖凝膠濃度與DNA分離范圍7 凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關(guān)，凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。 2 2）電泳緩沖液）電泳緩沖液 常用三種緩沖液 Tris-硼

5、酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE） TBE與TPE：緩沖容量高，DNA分離效果好，但TPE在DNA片段回收時(shí)含磷酸鹽濃度高，容易使DNA沉淀 TAE：緩沖容量低，但價(jià)格較便宜。緩沖液中的 EDTA 可螯合二價(jià)陽離子，從而抑制DNA酶的活性，防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物降解84 4）載樣緩沖液）載樣緩沖液 指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液 作用：增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)在電泳中形成肉眼可見的指示帶，可預(yù)測核酸電泳的速度和位置使樣品呈色，使加樣操作更方便9在凝膠電泳中，加入適量溴化乙錠（ethidium bromide，簡稱EtBr

6、）染料對核酸分子進(jìn)行染色，然后將電泳標(biāo)本放置在紫外光下觀察，可十分靈敏而快捷地檢測出凝膠介質(zhì)中DNA的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05g的微量DNA，也可以被清晰地檢測出來。在紫外線的照射下結(jié)合溴化乙錠的在紫外線的照射下結(jié)合溴化乙錠的DNADNA分子發(fā)出熒光分子發(fā)出熒光10 一、PCR技術(shù)原理 二、PCR技術(shù)主要類型 三、PCR技術(shù)主要應(yīng)用第三節(jié)第三節(jié) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)12Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即PCR技術(shù)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法。它可以快速將極微量的目的

7、基因或某一特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)十萬乃至千百萬倍。一、一、PCRPCR技術(shù)原理技術(shù)原理13（二）（二）PCRPCR的基本原理的基本原理 類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。首先將待擴(kuò)增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個(gè)PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。14PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC)Target SequenceTarget SequencePC

8、RPCR原理示意圖原理示意圖模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；16PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequencesTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；17PCR

9、 Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporatedTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase引物的延伸：引物的延伸：DNADNA模板模板- -引物引物結(jié)合物在結(jié)合物在TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶的作用下，以的作用下，以dNTPdNTP為反應(yīng)原為反應(yīng)原料，靶序列為模料，靶序列為模板，按堿基配對板，按堿基配

10、對與半保留復(fù)制原與半保留復(fù)制原理，合成一條新理，合成一條新的與模板的與模板DNA DNA 鏈。鏈。18End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequenceTarget SequenceTarget Sequence每完成一每完成一個(gè)循環(huán)需個(gè)循環(huán)需2 24 4分鐘，分鐘， 2 23 3小時(shí)小時(shí)就能將待就能將待擴(kuò)目的基擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放因擴(kuò)增放大幾百萬大幾百萬倍。倍。19（三）（三）PCRPCR反應(yīng)反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)條件：10X10X緩沖液緩沖液 10 10 L L4 4種種dNTPd

11、NTP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L引物引物 各各1010100pmol100pmol模板模板DNA DNA 0.10.12 2 g gTaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 2.5U2.5UMgMg2+ 2+ 1.5mmol/L1.5mmol/L201234522557294時(shí)間（min）溫度（）PCRPCR反應(yīng)反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍21PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)靈敏度高靈敏度

12、高 皮克皮克(pg=10(pg=10-12-12) )量級擴(kuò)增到微克量級擴(kuò)增到微克(ug=10(ug=10-6 -6) )水平水平 能從能從100100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞 病毒檢測的靈敏度可達(dá)病毒檢測的靈敏度可達(dá)3 3個(gè)個(gè)RFURFU（空斑形成單位）（空斑形成單位） 細(xì)菌檢測的最小檢出率為細(xì)菌檢測的最小檢出率為3 3個(gè)細(xì)菌個(gè)細(xì)菌簡便、快速簡便、快速 一次性加好反應(yīng)液，一次性加好反應(yīng)液，2 24 4 小時(shí)完成擴(kuò)增小時(shí)完成擴(kuò)增 擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對標(biāo)本的純度要求低對標(biāo)本的純度要求低u血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等血液、體腔液、洗嗽

13、液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提組織的粗提DNADNA22標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)的PCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系 10擴(kuò)增緩沖液 10ul 4種dNTP混合物 各200umol/L 引物 (上、下游引物) 10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加雙蒸水至 100ul（四）（四）PCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系231 1、PCRPCR反應(yīng)五要素（反應(yīng)成分）反應(yīng)五要素（反應(yīng)成分）引物（primers） 酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板 （template） Mg2+ （ma

14、gnesium）242）酶及其濃度）酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)天然酶：從嗜熱水生桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成 一個(gè)典型的 PCR反應(yīng)約需酶量 2.5U（指總反應(yīng)體積為100 ul時(shí)） 濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少253）dNTP dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度 四種dNTP濃度應(yīng)相等 濃度過高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過低濃度過高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量則降低反應(yīng)產(chǎn)量 dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。264 4）模板）模板 單、雙鏈DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶

15、抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。 一般100ng DNA模板/100L。 模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。285） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5-2.5mmol/L反應(yīng)體系。MgMg2+2+濃度過低會使?jié)舛冗^低會使TaqTaq酶活性喪失、酶活性喪失、PCRPCR產(chǎn)量下產(chǎn)量下降；降； MgMg2+2+過高影響反應(yīng)特異性。過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。292、循環(huán)參數(shù) 變性 使雙鏈DNA解鏈為單鏈 95oC 20-30秒(2) 退火 溫度由引物長度和GC含量決定。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合