第7章 基因工程菌大規(guī)模培養(yǎng)

1、第7章 基因工程菌的培養(yǎng)7.1工程菌的穩(wěn)定性 一、工程菌不穩(wěn)定的表現(xiàn) 工程菌的不穩(wěn)定實際上包括質粒的不穩(wěn)定及其表達產物的不穩(wěn)定兩個方面。具體表現(xiàn)為：質粒的丟失、重組質粒發(fā)生DNA片段脫落和表達產物的不穩(wěn)定。二、引起工程菌不穩(wěn)定的一些因素及對策 工程菌穩(wěn)定與否，取決于質粒本身的分子組成、宿主細胞的生理和遺傳特性及環(huán)境條件等三個方面工程菌不穩(wěn)定的因素：控制基因的過量表達，菌體的比生長速率，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)基的組成1、培養(yǎng)基的組成 質粒在豐富培養(yǎng)基比在低限培養(yǎng)基中更加不穩(wěn)定。合成培養(yǎng)基往往有利于宿主細胞的生長，但不利于外源基因的表達。 2、培養(yǎng)溫度 進行工程菌培養(yǎng)時必須探索其最佳培養(yǎng)溫度。通常低溫有利

2、于重組質粒的穩(wěn)定遺傳。 3、菌體的比生長速率 如果宿主菌的比生長速率比工程菌的大，質粒將嚴重丟失，導致工業(yè)上倒罐；如果宿主菌的比生長速率比工程菌小，大量繁殖時因竟爭性利用基質，宿主細胞將會受到抑制，對發(fā)酵影響不大。4、控制基因的過量表達 外源基因表達水平越高，重組質粒就越不穩(wěn)定?？梢圆捎脙呻A段培養(yǎng)法，即在發(fā)酵前期控制外源基因不過量表達，使質粒穩(wěn)定遺傳，到后期通過提高質粒的拷貝數和轉錄、轉譯效率使外源基因高效表達?？刂仆庠椿蜻^量表達的方法：1) 如構建含可誘導啟動子的工程菌，這種工程菌發(fā)酵生產時，可選擇培養(yǎng)條件使啟動子受阻遏制一定時間，在此期間質粒穩(wěn)定遺傳，然后通過去阻遏（誘導）使質粒高效表達

3、；2) 采用溫度敏感型質粒，溫度較低時質?？截悢瞪伲敎囟壬叩揭欢〞r質粒大量復制、拷貝數劇增。 7.2高密度培養(yǎng)為了大量獲得基因工程產品，通常采用高密度培養(yǎng)技術，即提高菌體的發(fā)酵密度，最終提高產物的比生產率(單位體積單位時間內產物的產量)的一種培養(yǎng)技術，通常指分批補料發(fā)酵技術。這樣不僅可減少培養(yǎng)體積、強化下游分離提取，還可縮短生產周期、減少設備投資，最終降低生產成本。一、重組大腸桿菌的高密度培養(yǎng) 重組大腸桿菌高密度發(fā)酵成功的關鍵是補料策略，即根據工程菌的生長特點及產物的表達方式采取合理的營養(yǎng)流加方案。 在重組大腸桿菌高密度發(fā)酵中，合理流加碳源降低“葡萄糖效應”是成功的關鍵。常見的流加技術有：

4、恒速流加、變速流加、指數流加和反饋流加。1、恒速流加 限制性基質以恒定流速流加進入發(fā)酵罐中供細胞生長和代謝用的一種培養(yǎng)技術。通常以補料前的耗糖速率作為流加補料速率。特點：1) 相對于發(fā)酵罐中的菌體來說，營養(yǎng)物的濃度逐漸降低;2) 比生長速率也慢慢降低;3) 菌體密度呈線性增加。 2、變速流加 限制性基質以變速或梯度增加流速流加進入發(fā)酵罐中供細胞生長和代謝用的一種培養(yǎng)技術。 特點：1) 這樣可以克服恒速流加中營養(yǎng)物的濃度逐漸降低的缺陷，菌體在較高密度下通過流加更多營養(yǎng)物質來促進菌體的生長，并對產物的表達有利。2) 比生長速率不斷改變。 3、指數流加 恒定比生長速率的一種流加限制性基質的培養(yǎng)技術。

5、是一種簡單而又有效的補料技術。特點：1) 流加速度指數增加，菌體密度也指數增加；2) 它能夠使發(fā)酵罐中基質的濃度控制在較低的水平，這樣就可以大大減少乙酸的積累；還可以通過控制流加速率來控制菌體的生長速率，使菌體穩(wěn)定生長的同時有利于外源蛋白的充分表達4、反饋流加 以發(fā)酵參數,如pH、DO、OUR、CER和菌體濃度，作為控制對象，控制流加速度，使發(fā)酵液中葡萄糖濃度維持在較低水平的一種流加培養(yǎng)技術。常見的有恒pH法和恒溶氧法。 A 恒pH法 大腸桿菌代謝葡萄糖產生乙酸將導致pH的降低，因此pH降低速率與葡萄糖消耗速率成正比。當pH降低過快時，說明葡萄糖過量，來不及完全氧化，產生了過量乙酸，即流加速度

6、過快，此時應將其流加速度減慢；否則相反。B 恒溶氧法 發(fā)酵過程當葡萄糖耗盡時，發(fā)酵液的溶氧將迅速升高。因此，發(fā)酵過程中溶氧水平和糖流加速率與工程菌的酵解過程和代謝物的完全氧化有很大關系。具體表現(xiàn)為：1) 缺氧即溶氧值低將迫使糖代謝進入酵解途徑，產生乙酸，對工程菌培養(yǎng)不利；2) 當補糖速率過快時，將導致部分糖無法及時氧化而進入酵解途徑。因此，可通過控制流加速度來控制溶氧水平，降低乙酸的積累。 具體控制策略：1) 當溶氧過低時，說明葡萄糖過量，此時應降低流加速率；2) 當溶氧過高時，說明葡萄糖即將耗盡，此時應加大流加速率。二、重組酵母菌的高密度培養(yǎng) 酵母是外源基因另一個常用的表達系統(tǒng)。其與大腸桿菌

7、表達系統(tǒng)相比具有一些明顯的優(yōu)勢，主要體現(xiàn)在：1) 酵母可達到更高密度培養(yǎng)，100 g /L(干細胞), 400 g/L(濕細胞)，500 OD600 2) 酵母一般很少分泌雜蛋白，這樣便有利于外源蛋白的提取和純化；3) 重組產物的表達水平高，畢赤酵母的表達水平比釀酒酵母高10100倍；4) 酵母作為一種模式真核生物，象許多真核生物一樣，它分泌的蛋白質一般都要經過一次或多次對其功能或穩(wěn)定性至關重要的翻譯后修飾糖基化，糖基化能保證蛋白質進行適當的折疊，從而保護蛋白質免受蛋白酶的降解作用，這在重組蛋白藥物中是十分重要的；5) 同樣糖基化使外源蛋白在宿主細胞中出現(xiàn)錯誤折疊的可能性比細菌要小得多，不像大

8、腸桿菌一樣外源蛋白常存在于包涵體中，則便能簡化外源蛋白的分離和純化工序。 常見的酵母表達系統(tǒng)有釀酒酵母和畢赤酵母，下面主要介紹重組畢赤酵母的高密度培養(yǎng)1、 原理畢赤酵母Pichia pastoris為甲醇利用型酵母，能以甲醇為唯一碳源和能源生長。甲醇利用途徑的第一個酶為醇氧化酶(AOX)。生長在限量甲醇中的細胞能誘導出大量該酶，而生長在甘油、葡萄糖或乙醇中的細胞卻不能產生該酶。因此，可利用醇氧化酶基因(AOX1)作為強啟動子來構建表達系統(tǒng)而高效表達外源蛋白。2、 影響外源基因在畢赤酵母中高效表達因素1) 表達菌株：最常用的宿主菌為GS115(his4)，為his營養(yǎng)缺陷菌。2) 表達載體：對于

9、非分泌蛋白采用胞內表達載體，對分泌蛋白則選擇分泌型載體3) 選擇強啟動子：最常用的啟動子為AOX1啟動子4) 信號肽的選擇：影響外源蛋白質分泌關鍵因素是外源蛋白基因本身，但是利用信號肽能更好地分泌蛋白。5) 增加外源基因整合拷貝數：畢赤酵母載體在宿主染色體上大多數為單拷貝整合，而且即使單拷貝也能獲得較高產量，但是也有一些例子表明提高拷貝數可大大增加表達水平。6) 轉化方法的選擇通過不同的轉化方法提高拷貝數。畢赤酵母的轉化方法主要有電激法、原生質體法和氯化鋰法。3、 高密度培養(yǎng)技術具體方法主要是下面的所謂“三段法”第一階段，在甘油或葡萄糖為碳源的合成培養(yǎng)基中進行工程菌的分批培養(yǎng)，以積累菌體細胞；

10、第二階段，在限制生長速率下流加甘油或葡萄糖的流加補料培養(yǎng)，以進一步提高菌體量；第三階段，即誘導階段，開始較低速度流加甲醇，以誘導外源蛋白的表達。近年來，又出現(xiàn)了所謂混合補料工藝，即在誘導階段，以一定比例和速度流加甲醇和甘油混合料液。該工藝的主要優(yōu)點是：1) 提高細胞存活力；2) 縮短誘導時間；3) 提高重組蛋白的生產速率。但是過量甘油的流加，又將抑制甲醇利用途徑，導致外源蛋白的表達水平降低。重組畢赤酵母的大規(guī)模培養(yǎng)的高密度培養(yǎng)時要注意控制代謝副產物乙醇的量，同時還要注意控制甲醇的流加量，它們都將抑制細胞的生長，后者還將影響表達水平。控制甲醇的流加量措施：恒溶氧(DO)法：當甲醇流加速率過快時，D