P物質(zhì)對變應(yīng)性鼻炎動物模型鼻粘膜上皮短路電流的影響

1、            Effect of substance P on the short-circuit current of nasal mucosal epithelium 劉濤 楊平常 王斌全 張念祖 王長生 Liu Tao, Yang Pingchang, Wang Binquan, et al 【摘要】 目的 觀察P物質(zhì)（SP）作用于變應(yīng)性鼻炎動物模型鼻粘膜引起的離子分 泌改變導(dǎo)致的上皮表面短路電流（Short-circuit current, Isc）的變化。

2、方法 以雞蛋清蛋 白致敏大鼠后，用Ussing室技術(shù)測定鼻粘膜上皮表面短路電流。并觀察神經(jīng)激肽受體 （NK1）拮抗劑CP96345、組胺H1受體拮抗劑吡拉明、H2受體拮抗劑雷尼替丁和河豚毒素 對SP的阻斷作用。結(jié)果 經(jīng)SP刺激，致敏大鼠鼻粘膜表面Isc顯著增高。經(jīng)四種物質(zhì)預(yù) 處理均能顯著阻斷SP引起的Isc變化。結(jié)論 SP經(jīng)感覺神經(jīng)末梢釋放后，可引起上皮表 面離子電位變化、上皮通透性增高等一系列鼻粘膜病理變化。 【關(guān)鍵詞】 鼻粘膜 P物質(zhì) 鼻炎，變應(yīng)性，常年性 河豚毒素 Effect of substance P on the short-circuit current of nasal mu

3、cosal epithelium Liu Tao, Yang Pingchang, Wang Binquan, et al. Department of Otolaryngology, First Affiliated Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan, 030001 【Abstract】 Objective To observe the changes of epithlial apical membrane short-circuit current (Isc) of antigen-sensitized rat nasal muco

4、sa with the stimulation of Substances P (SP).Methods The epithelial apical membrane Isc were measured with Ussing chamber technique, and and we observed the blockage to the effect of SP by neurokinin receptor antagonist Cp96345, histamine H1 receptor antagonist pyrilamine, H2 antagonist renitidine a

5、nd neurotoxin respectively. Results The Isc increased significantly with the stimulation of SP. The effect of SP on Isc could be blocked significantly by pretreatment with four substances. Conclusion SP releasing from nervous endings plays the role on elicit a series of pathological changes like enh

6、anced Isc,epithelial permeabilities, etc. 【Key words】 Nasal mucosal Substance P Rhinitis, allergic, perennial Tetrodotoxin 鼻部變應(yīng)性鼻炎導(dǎo)致的鼻粘膜功能改變包括鼻分泌物增多，血管和上皮通透性增高1、 粘膜腫脹等。引起這些改變的機理還沒完全明了。由于肥大細胞和神經(jīng)遞質(zhì)引起的鼻粘膜上 皮離子分泌的改變可能在其中有重要作用。我們采用經(jīng)典的測定上皮離子電流（Isc）的Ussing 室技術(shù)，檢測P物質(zhì)(SP)作用于鼻粘膜引起的離子分泌變化導(dǎo)致的上皮表面Isc的改變。 材料和方法 一

7、、致敏動物 選用成年雄性、健康SD大鼠60只，體重200250 g，購于本校實驗動物中心。致敏方 法：每只大鼠用1 mg雞蛋清蛋白(EA, V級, Sigma 公司, 美國)加氫氧化鋁凝膠為佐劑，腹 腔注射。另取百日咳桿菌毒素100 mg(Scalvo 研究所，意大利)腹腔注射，2周后重復(fù)注射 1次，然后每日在鼻腔滴同樣濃度的雞蛋清蛋白1次，連續(xù)5天2。 在取鼻粘膜標本的同時經(jīng)心臟穿刺取血分離血清進行被動皮膚轉(zhuǎn)移試驗（PCA）3。 方法簡述為：取健康大鼠60只，背部剃毛5 cm×5 cm，致敏大鼠血清稀釋成164、1128、 1256、1512四種濃度，取0.1 ml皮下注射，8天后

8、經(jīng)靜脈注射EA抗原500 g（溶于0.5% 伊文思藍溶液1 ml中），觀察原注射致敏血清部位皮膚藍色斑點的直徑，大于5 mm定為陽性 反應(yīng)，證實動物造模成功。PCA的滴度在1641512之間。實驗前一日用EA抗原滴鼻，動 物出現(xiàn)用前爪撓鼻，發(fā)出“吭吭”聲，前鼻孔有液滴等類似變應(yīng)性鼻炎的臨床表現(xiàn)。 二、Ussing室Isc測定裝置和技術(shù) Ussing室裝置由A、B室、電極、電生理儀、電子計算機、37溫水循環(huán)系統(tǒng)和氧氣循環(huán)系 統(tǒng)組成。待測粘膜標本置于A室和B室之間的標本臺上，上皮面朝向A室，標本臺有一1.0 cm×0.6 cm 的通道連接A室和B室，粘膜標本橫置于該通道中將通道完全隔斷。

9、在A室和B室中加進37充氧 的Kreb緩沖液(配方為：NaCl 1.5, KH2PO4 2.0, MgCl2 1.1, CaCl21.25, NaHCO3 25, KCl 8, 單位為mmol/L)，每側(cè)8 ml，A室的緩沖液中還含有10 mmol/L的甘露醇，B室緩沖液中還含有 10 mmol/L的葡萄糖。Ussing室的熱水循環(huán)系統(tǒng)使緩沖液保持在37，給緩沖液持續(xù)充氧。 動物在深度麻醉下斷頭剖開鼻腔，迅速取下鼻中隔粘膜（包括鼻頂和鼻粘膜），平鋪在 標本臺上，上皮面朝向A室，標本臺立即裝配，在雙側(cè)Ussing室中加入緩沖液。雙側(cè)的鼻中隔 粘膜分別裝于兩套Ussing室裝置，各種處理完全相同，

10、取其結(jié)果的平均值。 三、SP激發(fā)試驗 雞蛋清蛋白致敏的SD大鼠20只，分成4組，每組5只。按上述方法取鼻中隔粘膜裝于Ussing 室裝置，平衡15分鐘，分別將不同濃度的SP加入A室的緩沖液中刺激鼻粘膜，使之終濃度分別 為10-8、10-7、10-6、10-5mol/L，即每組動物接受其中一種濃度的SP刺激。由電子計算機持續(xù)記錄Isc。 四、四種化學(xué)物質(zhì)對SP的阻斷作用的觀察 取經(jīng)雞蛋清蛋白致敏的大鼠40只，分成A、B、C、D、E、F、G、H 8組，每組5只。實 驗步驟同前。平衡15分鐘后，分別用下列化學(xué)物質(zhì)加進A室緩沖液中對標本進行預(yù)處理5分 鐘，再加10-6mol/L的SP進A室中刺激，記錄

11、Isc。預(yù)處理的化學(xué)物質(zhì)(均購于Sigma公司)如下： A、B、C 3組分別用5×10-6、10-5、5×10-5 mol/L的NK1受體拮抗劑CP96345，D組用5×10-7mol/L 吡拉明，E組用5×10-6mol/L雷尼替丁，F(xiàn)組用10-6mol/L河豚毒素，G組用吡拉明聯(lián)合河豚毒 素預(yù)處理，濃度同上。H組為對照組，不作預(yù)處理，僅用10-6mol/L的SP刺激。 結(jié) 果 在加各種刺激藥物和拮抗劑之前，標本在Ussing室裝置上平衡15分鐘。在此期間記錄 到的基線各組相同，平滑，無波動，示基線平穩(wěn)。在A室加進SP從表面刺激致敏鼻粘膜，  

12、;                23分鐘后Isc迅速增大，在1分鐘內(nèi)達到高峰，約持續(xù)3分鐘下降到基線水平。10-8mol/L的 SP即可引起Isc增大，10-6mol/L使反應(yīng)增到最大值，雖將SP濃度升高到10-5mol/L， Isc也不再繼續(xù)增大(表1)。 表1 不同SP刺激致敏鼻粘膜引起的Isc(A/cm2) SP濃度(mol/L) 動物數(shù) s 10-8 5 10.61 4.12 10-7 5 25.12 5.31 10-6 5 65.14

13、 6.66 10-5 5 60.48 5.45 C組動物用NK1受體拮抗劑預(yù)處理再用10-6mol/L的SP刺激，Isc和對照組比較顯著減弱， 但未回到基線水平；組胺H1、H2拮抗劑預(yù)處理（D、E組），也分別部分地阻斷了SP引起的 Isc升高；河豚毒素預(yù)處理（F組）對SP引起的Isc升高亦有顯著阻斷作用；用組胺H1受體拮 抗劑聯(lián)合河豚毒素預(yù)處理（G組），對SP引起的Isc升高有更大的阻斷作用，其阻斷效果高 于前述任何一種阻斷方法。分別用t檢驗對實驗組和對照組的結(jié)果進行比較，差異都有顯著 性 (表2)。 表2 幾種化學(xué)物質(zhì)與對照組比較使用10-6 mol/L濃度的對SP鼻粘膜Isc的差異 組別

14、動物數(shù) s t 值 P值 A 5 21.34 3.34 13.97 0.001 B 5 17.36 4.15 14.34 0.001 C 5 14.56 3.39 16.22 0.001 D 5 32.14 4.56 9.29 0.001 E 5 41.49 5.38 5.96 0.001 F 5 21.42 3.03 14.27 0.001 G 5 10.12 2.19 19.29 0.001 H 5 62.23 5.63 G與D比較:t9.73, P0.001; G與F比較:t6.76, P0.001 討 論 鼻粘膜中分布有豐富的神經(jīng)末梢，大部分位于粘膜下層，但有一部分感覺神經(jīng)末 梢穿過上

15、皮細胞間的緊密連接到達鼻粘膜表面，可接受鼻腔的物理、化學(xué)刺激。已有 報道，鼻粘膜中含有豐富的SP能神經(jīng)纖維，鼻變應(yīng)性疾病中時SP能神經(jīng)功能增強4。 SP來源于感覺神經(jīng)中的C類纖維，這些神經(jīng)纖維和肥大細胞有密切聯(lián)系，肥大細胞是變 應(yīng)性鼻炎化學(xué)介質(zhì)的主要來源。因此可以推測在變應(yīng)性鼻炎中，鼻粘膜SP神經(jīng)和肥大細 胞的相互作用的結(jié)果可導(dǎo)致上皮細胞離子分泌特性的改變，進而引起鼻粘膜上皮通透性 及分泌功能異常，導(dǎo)致一系列的生理、病理學(xué)變化。 正常人鼻粘膜上皮表面存在有離子電位，電細胞內(nèi)外離子濃度差形成，主要涉及Na+、 K+、Cl-三種離子。在上皮細胞的吞噬活動和通透性增加時，Cl-從細胞內(nèi)向細胞外運動增

16、 加，同時也有Na+的向細胞內(nèi)運動，因而形成電化學(xué)電流和電位5。近年來人們注意到P 物質(zhì)在鼻變應(yīng)性疾病中的發(fā)病機理中有重要作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)變應(yīng)性鼻炎患者血漿和鼻分泌 物中SP含量顯著高于正常人4，用SP刺激鼻粘膜可以誘導(dǎo)出變應(yīng)性鼻炎的臨床表現(xiàn)，使 用辣椒辣素處理能使變應(yīng)性鼻炎動物模型鼻粘膜中的SP含量減少，病變減輕。已有報道指 出，SP可以使呼吸道上皮或血管通透性增加6，系通過激動NK1受體途徑引起。神經(jīng)激 肽受體有NK1、NK2、NK3三種，SP可以和這3種受體結(jié)合，但親和性最高的是NK17，因 此NK1受體在呼吸道變應(yīng)性疾病中的作用已日益受到重視。研究結(jié)果表明，用SP刺激鼻粘 膜，使Isc迅

17、速增大，并呈正向量效關(guān)系，說明SP引起了上皮細胞離子分泌特性改變，提 示上皮的通透性等功能也發(fā)生變化8。經(jīng)NK1受體拮抗劑預(yù)處理，SP引起Isc增大的作用 被顯著阻斷，進一步佐證了SP可能引起Isc增高并可能經(jīng)與NK1受體介導(dǎo)有關(guān)。 用SP刺激粘 膜下層的神經(jīng)元可以使之釋放多種神經(jīng)源性化學(xué)介質(zhì)9，因而在本實驗結(jié)果中，也可能 有SP的直接效果和由它刺激粘膜中神經(jīng)組織釋放的其它神經(jīng)肽或神經(jīng)遞質(zhì)的作用而產(chǎn)生的 間接效果。在使用河豚毒素預(yù)處理后，SP引起的Isc顯著下降，說明其中有神經(jīng)介導(dǎo)因素參與。 作者單位： 030001 太原 山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉科 參考文獻 1Kawakuchi S,

18、Ukai K, Jin C, et al. Effect of histamine on nasal epithelial permeability to horseradish peroxidase in allergic guinea pigs. Ann Otol Rhinol Laryngol, 1995, 104:394-401. 2Tanaka KL, Okamoto Y, Nagaya Y, et al. A nasal allergy model developed in guinea pig by intranasal application of 2,4-toluene di

19、isocynate. Int Arch Allergy Appl Immunol, 1988,85:392-400. 3Aibara S, Mori M, Tsubaokawa M, et al. Antiallergic activity of 6-(2-cyclohexylethyl)-1,3,4 thiadiazolo-4，5-d pyrimidin-9(3H)-one(DS-4574) in rats. Int Arch Allergy Immunol, 1992, 98:146-152. 4Chaen T, Watanabe N, Mogi G, et al.Substance P and vasoactive intestinal peptide in nasal secretions and plasma from patients with nasal allergy. Ann Otol Rhinol Laryngol, 1993, 102: 16-21. 5Chinet TC, Fullton JM, Yankaskas JR, et al. Sodium-permeable channels in the apical membrane of human nasal e