生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境科學(xué)卷期副本

1、生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境科學(xué) 2003年16卷03期 267275頁懷牛膝多糖和枸杞多糖在右旋半乳糖誘導(dǎo)小鼠衰老模型中非酶轉(zhuǎn)化的抑制作用鄧宏斌，崔大鵬，蔣建明，馮艷春，蔡年生，李殿東藥用生物技術(shù)研究所，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院和北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京 10050，中國目的：探討懷牛膝多糖（ABP）和枸杞多糖（LBP）在右旋半乳糖誘導(dǎo)小鼠衰老模型中非酶轉(zhuǎn)化的抑制作用和機(jī)理。方法：血清年齡水平是由年齡-酶聯(lián)免疫吸附，MTT法來確定，它們通常用于確定淋巴細(xì)胞增殖，IL-2活動(dòng)由一種生物測定方法決定。自發(fā)活動(dòng)被用于檢測老鼠的神經(jīng)肌肉活動(dòng)，延遲的單步調(diào)試的方法被用來檢查小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，比色測定法被用來測定小鼠皮膚中羥脯

2、氨酸的濃度，鄰苯三酚自氧化法用來確定紅細(xì)胞的超氧化物歧化酶（SOD）的活性。結(jié)果：在小鼠體內(nèi)注入ABP或LBP后，我們發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)血清年齡水平降低，羥脯氨酸在小鼠皮膚中的含量降低和自發(fā)運(yùn)動(dòng)活動(dòng)在右旋半乳糖小鼠衰老模型被檢測到，同時(shí)淋巴細(xì)胞增殖和IL-2活動(dòng)、學(xué)習(xí)和記憶能力、紅細(xì)胞的SOD活性都增強(qiáng)了。結(jié)論：ABP和LBP能抑制右旋半乳糖誘導(dǎo)小鼠衰老模型中小鼠體內(nèi)非酶轉(zhuǎn)化，ABP比LBP有更好的抑制作用。關(guān)鍵字：懷牛膝多糖（ABP）；枸杞多糖（LBP）；右旋乳糖；非酶轉(zhuǎn)化；老化介紹我們之前的工作表明，給小鼠注射右旋半乳糖可以誘導(dǎo)類似加速老化的變化。老化模型顯示，神經(jīng)損傷會(huì)減少抗氧化酶活動(dòng)，而產(chǎn)生

3、輕微的免疫反應(yīng)，ABP是一種從中國草藥牛膝的根中提取的活性成分。布魯姆的研究表明，ABP能夠加強(qiáng)免疫系統(tǒng)的免疫能力，抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，增加白細(xì)胞的數(shù)量，從而保護(hù)了肝細(xì)胞。枸杞多糖（LBP）是一種從枸杞中提取的生物活性物質(zhì)，它可以提升T，B，CTL，NK和M 細(xì)胞因子增強(qiáng)受腫瘤痛苦的小鼠和輻照受損小鼠的功能免疫，調(diào)節(jié)NIM網(wǎng)絡(luò)，本研究的目的在于調(diào)查ABP和LBP在右旋半乳糖誘導(dǎo)小鼠衰老模型中的效果，包括神經(jīng)活動(dòng)，血清年齡水平，皮膚羥脯氨酸濃度和自發(fā)運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，淋巴細(xì)胞核擴(kuò)散和IL-2活動(dòng)，學(xué)習(xí)和記憶能力，紅細(xì)胞SOD活性。材料和方法受試物懷牛膝多糖（ABP）和枸杞多糖（LBP）由袁天根教授，上海有

4、機(jī)化學(xué)研究所，中國科學(xué)院提供。藥物應(yīng)該放在含有PBS和濾過0.22um膜的生理鹽水。動(dòng)物與治療選用三個(gè)月大的雌性小鼠C57BL/6J（總共32只，18g22g重，由中國科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，CAMS），并隨機(jī)分為4組，每組8只小鼠。一周適應(yīng)期后，小鼠們將會(huì)進(jìn)行下列一系列的一個(gè)8周的日常治療：1、給第一組的小鼠每只注射0.4ml PBS作為媒介物控制；2、給第二組小鼠每只按50mg/kg注射右旋半乳糖；3、給第三組小鼠每只按50mg/kg右旋半乳糖+100mg/kg ABP；4、給第四組小鼠按50mg/kg右旋半乳糖+100mg/kg LBP。8周以后，4組小鼠將會(huì)被殺死，并及時(shí)將它們的血清，

5、器官和組織收集起來，為后面實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備，將它們存儲(chǔ)在-70溫度下。年齡酶聯(lián)免疫吸附測定年齡的定量測定將會(huì)由年齡酶聯(lián)免疫吸附法來測定。簡單地說，在96孔板上涂一層3ug/ml AGE-BSA，每孔100ul，放在4涂料緩沖液中過夜?？装逵?50ul洗滌液（PBS，0.05二層20,1mmL/L NaN3）沖洗3次，然后再控板上注滿1的正常山羊血清在100ulPBS在37下2小時(shí)。經(jīng)過洗滌后，50ul的1:10稀釋血清（樣本）。添加稀釋緩沖液（PBS，0.02二層20,1mmol/L，NaN3，1正常山羊血清)和50ml多克隆抗血清抗年齡在稀釋緩沖液（1:3000）?？装宸旁谑覝叵路趸?小時(shí)，并在一

6、個(gè)水平旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)床下溫和攪拌。洗凈后，補(bǔ)充100ml堿性磷酸鹽共軛液和抗體稀釋緩沖液（1:2000），把孔板放在37下孵化1小時(shí)?？装逡裆鲜瞿菢幼忧逑?次，添加100ul的對(duì)硝基苯磷酸液到每一個(gè)孔板上。然后在3060分鐘培養(yǎng)后，在光學(xué)密度（OD）405nm下同酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）顯微鏡下觀察讀數(shù)（3550，Bio-Rad）。AEG-BSA被用來作為一種競爭抗原來生成一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。樣品的年齡值將由標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算。淋巴細(xì)胞的增值誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 淋巴細(xì)胞增殖將會(huì)進(jìn)行一些描述性可接受的改變。動(dòng)物死后在無菌條件摘除脾臟，細(xì)胞懸浮液的摩擦對(duì)無菌不銹鋼組織鋼絲網(wǎng)(100um)在10毫升磷酸鹽緩沖

7、液中。污染細(xì)胞溶解的紅細(xì)胞是治療細(xì)胞球放在5毫升三羥甲基氨基甲烷-氨基鹽氯溶解緩沖液（0.1 8摩爾/升 氯化銨在0.1 7摩爾/升 三羥甲基氨基甲烷 pH值7.2)在室溫下放置2分鐘。然后用磷酸緩沖液清洗，脾淋巴細(xì)胞是放在100 uL無血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)基(RPMI) 1640介質(zhì)中在10 6細(xì)胞/孔板 有或沒有7 ug /毫升伴刀豆球蛋白（ConA）?？装逶?7下孵化44小時(shí)后,，20 uL氯丁膠新型交聯(lián)劑（MTT）(5毫克/毫升)添加到每個(gè)孔板和培養(yǎng)基中，在37培養(yǎng)6小時(shí)。讀數(shù)在顯微感光版閱讀器(型號(hào)3550,生物閱讀)在波長570 nm處。增殖的淋巴細(xì)胞被表示為刺激指數(shù)(外直徑OD在57

8、0nm的測試樣品/ OD的570nm非刺激控制淋巴細(xì)胞)。IL-2測定 IL-2活動(dòng)決定使用生物測定,如前面描述的淋巴細(xì)胞是在5 x 106細(xì)胞培養(yǎng)/毫升24 h與7 ug /毫升伴刀豆球蛋白（ConA），將其無細(xì)胞上清培養(yǎng)液收集起來。重組人類IL-2標(biāo)準(zhǔn)和測試上層清液，用無血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)液（RPMI）稀釋1640介質(zhì)在96孔微文化板塊(1 00 uL /毫升)，和100 uL的細(xì)胞株-2（CTLL-2）細(xì)胞(寫明ATCC)在4×105細(xì)胞/毫升RPMI 1640培養(yǎng)基中添加到每個(gè)孔板。這些細(xì)胞在解散深藍(lán)色水晶中37下孵化6 h。OD在570nm是由一個(gè)顯微感光版讀者和IL-2活動(dòng)

9、，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，數(shù)據(jù)被表示為U /毫升。自發(fā)運(yùn)動(dòng)活動(dòng)測試 光電管籠的方法應(yīng)用于測試自發(fā)的神經(jīng)活動(dòng)的老鼠,光電管裝置(XZ-4模型，研究所綱目，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院)由四個(gè)黑框(19×10厘米)。四光束與相應(yīng)的光電管盒在外圍的自發(fā)運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，老鼠被發(fā)現(xiàn)使用一個(gè)光電檢測器在結(jié)束治療老鼠被放置進(jìn)一箱一箱/框。2分鐘適應(yīng)后，自發(fā)活動(dòng)被記錄了10分鐘的活動(dòng)，利用磷酸緩沖液治療年輕老鼠被認(rèn)為是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的100%活動(dòng)特聘數(shù)據(jù)分析。進(jìn)一步通過測試獲取內(nèi)存 這個(gè)步驟通過方法被用來評(píng)估學(xué)習(xí)和記憶的能力，老鼠的試驗(yàn)裝置(36 x 12×12厘米,MX-5模型，研究所綱目，中醫(yī)學(xué)科學(xué)院)包括兩個(gè)隔間:

10、一個(gè)黑盒,一盒光照亮高25厘米的頂部室。在兩個(gè)框之間有一個(gè)直徑3厘米的洞，在最后10天的處理，每個(gè)老鼠被放置在照明箱未用頭撞擊孔。當(dāng)小鼠進(jìn)入黑暗盒中，一個(gè)超足部電擊(30 V,50赫茲)通過整個(gè)籠子網(wǎng)格。小鼠要逃離電擊只有退到被照亮的“安全”側(cè)。老鼠被每天訓(xùn)練了5分鐘,進(jìn)行1 0天記憶測試。在測試后，小鼠被放置到照明箱和延遲時(shí)間(以秒計(jì)算)和大量的錯(cuò)誤記憶將會(huì)被記錄5分鐘。用磷酸緩沖液處理的小鼠將會(huì)被用作對(duì)比。羥脯氨酸測定 小鼠死后,皮膚樣品從小鼠后背取。從每個(gè)小鼠身上取25mg(干重)的脫脂樣本水解在2毫升 6mmol/L鹽酸中，在140解析6 h。樣本用氫氧化鈉中和，然后溶解在15毫升蒸餾

11、水中。1毫升水解物的解決方案添加下列順序:1毫升氯胺T(1.41%),1毫升3.156 mol / L,1毫升高氯酸試劑(20% p二甲氨基-對(duì)羥基苯甲醛)形成發(fā)色團(tuán)為560 nm標(biāo)準(zhǔn)羥脯氨酸解決方案是用來生成一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線從15ug /毫升。超氧化物歧化酶(SOD)測定 SOD活性測定紅細(xì)胞通過測量抑制鄰苯三酚使用一個(gè)先前發(fā)表的自然氧化法與一些修改。焦棓酸解決方案(0.1mmol/ L)準(zhǔn)備好了1毫米三鹽酸,pH8.2。一個(gè)穩(wěn)定的自氧化速率是達(dá)到和變化在325的OD 0.07 /分鐘在房間溫度的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，曲線是由0.1 -0.5 ug /毫升SOD。樣本OD隨后被測量和活動(dòng)是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

12、數(shù)據(jù)分析 值被表示為x s。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異實(shí)驗(yàn)組織是由學(xué)生的學(xué)習(xí)評(píng)價(jià)。結(jié)果血清年齡水平與右旋半乳糖小鼠顯示水平增加血清年齡(6.38 + -1.55)而對(duì)照組小鼠(2.79 - 0.96)(P < 0.01),治療組小鼠的血清年齡水平加上ABP與右旋半乳糖或LBP,分別為4.27 0.78和5.18 1.14(P < 0.01),分別表明ABP和LBP能防止年齡增加治療的小鼠右旋半乳糖(圖1). 圖1 血清年齡水平的年輕和治療小鼠血清年齡水平所決定的一個(gè)數(shù)據(jù)定量年齡酶聯(lián)免疫吸附測定被表示為相對(duì)年齡單位/毫升(x + j,n = 8)。p < 001vs年輕,p <

13、001。p < 0.05 VS右旋半乳糖。IL-2生物測定 與右旋半乳糖小鼠表現(xiàn)出明顯降低淋巴細(xì)胞增殖(2.08 0.25)和IL一2生產(chǎn)(9.32 1.54)體外相比三月大的對(duì)照組(p < 0.0 1)真好與右旋半乳糖小鼠加上ABP或LBP有一個(gè)增加淋巴細(xì)胞增殖和IL一2生產(chǎn)(p < 0.01),表明下降的免疫反應(yīng)治療的小鼠了右旋半乳糖ABP或LBP和ABP有一個(gè)更好的抑制效果比LBP(圖2)。 圖2 淋巴細(xì)胞增殖和IL一2生產(chǎn)的年輕和治療的小鼠(A)伴刀豆球蛋白-引誘的(7 ug /毫升)脾淋巴細(xì)胞增殖氯丁膠新型交聯(lián)劑（MTT）法刺激指數(shù)計(jì)算,:在570的測試樣品OD /

14、 OD在570的非刺激控制。(B)IL一2活動(dòng)(U /毫升)在伴刀豆球蛋白-治療的脾臟的淋巴細(xì)胞是由一個(gè)生物測定數(shù)據(jù)被表示為x + s。n = 8,cP < 0.01 vs年輕,P < 0 01 cp < 0.05 vs右旋半乳糖。自發(fā)運(yùn)動(dòng)活動(dòng)運(yùn)動(dòng)是由自發(fā)運(yùn)動(dòng)活動(dòng)右旋半乳糖。治療顯著降低小鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)活動(dòng)的年輕人(155 + 45)與對(duì)照組比較(282 + 66)(p < 0.0 1),是預(yù)防用真菌性右旋半乳糖，額外的治療ABP或LBP(p < 0.05)(圖3),抑制性能的ABP比LBP的高17.5%。圖3 年輕小鼠的自發(fā)運(yùn)動(dòng)活動(dòng)和治療老鼠。小鼠從不同組中集中起來

15、，放置在光電管籠子和自發(fā)運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，記錄電子日期被表示為平均每10分鐘活動(dòng)(x +年代,n = 8)計(jì)算:每組的活動(dòng)/活動(dòng)群bp < 0.01VS年輕，aP< 0.05 VS右旋半乳糖。小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力學(xué)習(xí)和記憶能力進(jìn)行了延遲的單步調(diào)試方法。右旋半乳糖小鼠體內(nèi)顯示減少延遲的步驟通過(130 - 36)(P < 0.0 1)和更多的錯(cuò)誤試驗(yàn)(0.74 + 0.47)比試驗(yàn)縮短延遲時(shí)間和增加內(nèi)存錯(cuò)誤在右旋半乳糖小鼠預(yù)防治療ABP或LBP治療(P < 0.0 1)(圖4)。延遲時(shí)間的抑制作用ABP是28.7%高于LBP但錯(cuò)誤的ABP和LBP治療組兩個(gè)低于右旋半乳糖組。羥脯氨

16、酸濃度的皮膚和紅細(xì)胞SOD活性用右旋半乳糖治療的年輕小鼠會(huì)導(dǎo)致增加皮膚羥脯氨酸內(nèi)容(63.44 + 8.00)和紅細(xì)胞SOD活性下降(3.7±1.8)(P < 0.01),而皮膚羥脯氨酸含量和紅細(xì)胞SOD活性下降后上升另外治療ABP或LBP,就是說,是預(yù)防的效果。右旋半乳糖從ABP 或LBP中提取(圖5)。討論 非酶轉(zhuǎn)化廣泛被認(rèn)同作為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的一種機(jī)制關(guān)于糖尿病和糖尿病并發(fā)癥。先前的研究也從我們的實(shí)驗(yàn)室證明先進(jìn)的糖化機(jī)理可以解釋右旋半乳糖衰老模型，已成為一個(gè)熱點(diǎn)搜索抑制劑的非酶轉(zhuǎn)化在最近幾年傳統(tǒng)中藥具有二千年歷史的一直被證明是非常有效的養(yǎng)護(hù),這啟發(fā)人和糖尿病,許多研究人員在中國

17、已經(jīng)開始研究抑制作用的中藥在非酶轉(zhuǎn)化一些化合物,如槲皮素,水飛薊素,一直全面研究和顯示抑制效應(yīng)在非酶轉(zhuǎn)化體外和體在這項(xiàng)研究中,我們的結(jié)果表明,治療組ABP或LBP顯著降低血清年齡層次、內(nèi)存延遲時(shí)間和錯(cuò)誤率,和皮膚羥脯氨酸過敏的老鼠也有顯著增加電動(dòng)機(jī)的活動(dòng),淋巴細(xì)胞增殖,藥物生產(chǎn)和超氧化物歧化酶(SOD)活性。所有這些結(jié)果表明ABP和LBP是新的中藥可以防止非酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)體內(nèi)。無論是人類和動(dòng)物，衰老有關(guān)的免疫功能下降。免疫功能的下降與年齡相關(guān)傳染性疾病增加。惡性腫瘤、自身免疫性疾病有絲分裂原誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖和IL-2生產(chǎn)標(biāo)記老化。這項(xiàng)調(diào)查的發(fā)現(xiàn),動(dòng)物治療ABP或LBP顯示增加了與淋巴細(xì)胞增殖和IL

18、一2生產(chǎn)支持這可以防止ABP和LBP的下降通過抑制免疫功能非酶轉(zhuǎn)化。圖4 延遲時(shí)間和記憶錯(cuò)誤率的年輕的被治療的小鼠體內(nèi)。步驟通過方法被用來確定延遲時(shí)間(A)和記憶錯(cuò)誤率(B).。每只小鼠是訓(xùn)練了5分鐘先“記住”系統(tǒng)十天后,老鼠被放置在同一個(gè)籠子和延遲時(shí)間(秒)和錯(cuò)誤的數(shù)量記錄電子。n = 8，aP<0.01 vs年輕,bp < 0.05 vs右旋半乳糖。 圖5 羥脯氨酸含量和SOD活性在年輕和小鼠體內(nèi)。(A)在皮膚羥脯氨酸濃度的鼠標(biāo)是由一個(gè)比色測定數(shù)據(jù)被表示為x±s(ug /毫克干組織)。(B)草皮活動(dòng)在紅細(xì)胞的測定和數(shù)據(jù)被表示為x±s(100 u/mL血液).

19、 = 8,bp < 0.01 VS年輕的p < 0.01 vs右旋半乳糖。 神經(jīng)系統(tǒng)老化是一個(gè)復(fù)雜的過程之前的報(bào)告表明：在右旋半乳糖小白鼠那里都是增加的脂褐質(zhì),丙二醛、單胺氧化酶B,和超氧化物歧化酶在大腦、心臟和肝臟,并降低程度的過氧化物歧化酶(SOD)在血清這些更改可能會(huì)直接或間接地導(dǎo)致大腦衰老。我們的研究結(jié)果表明,可以防止ABP或LBP下降的神經(jīng)系統(tǒng)函數(shù)通過抑制非酶轉(zhuǎn)化。 自由基方面起著非常重要的關(guān)鍵作用。SOD是一個(gè)關(guān)鍵酶在身體的衰老過程中，除老化當(dāng)身體老化時(shí)，身體的本能能力會(huì)清除自由基使其含量降低，同時(shí)SOD也減少。蛋白質(zhì)會(huì)改性由于年齡可能產(chǎn)生大量的自由基，在氧化的超氧化物

20、歧化酶的活性會(huì)降低或失去的身體產(chǎn)生的超氧化物歧化酶。在我們研究中，在紅細(xì)胞SOD活性活動(dòng)降低右旋半乳糖可以被ABP或LBP抑制。結(jié)果表明ABP或LBP能夠抑制降低SOD活性和提高能力消除自由基和防止非酶轉(zhuǎn)化。 老化的膠原蛋白交聯(lián)理論認(rèn)為增加膠原蛋白的交叉-鏈接在老化可能導(dǎo)致減少敏感性對(duì)酶和減少膠原蛋白的溶解性，彈性，靈活性。皮膚中的羥脯氨酸含量間接標(biāo)記為膠原蛋白含量。在這項(xiàng)研究中，增加皮膚中羥脯氨酸含量即右旋半乳糖誘導(dǎo)可以抑制ABP或LBP，結(jié)果表明ABP或LBP可以延遲膠原蛋白衰老通過抑制非酶轉(zhuǎn)化。 從我們的研究結(jié)果我們得出結(jié)論，ABP比LBP有更好的效果在抑制非酶轉(zhuǎn)化方面。那為什么會(huì)發(fā)生這

21、種情況呢？是不是有一個(gè)共同的機(jī)制傳統(tǒng)的中藥多糖在抑制非酶轉(zhuǎn)化？這是一個(gè)等待進(jìn)一步的研究問題。參考文獻(xiàn)1. Song，X.Bao，M.M,Li,D.D,和Li,Y.M.(1999).在右旋半乳糖誘導(dǎo)小鼠衰老模式中的先進(jìn)糖化.機(jī)械老化發(fā)展.108期.241 - 253頁.2.Li,Z.K.D.D.(1997),懷牛膝的免疫調(diào)節(jié)性能.藥學(xué)學(xué)報(bào).32期.881 - 887頁.3.Wang,Y.Zhao,H.Sheng,X,Gambino,P,E,Costello,B,和Bojanowski，K.(2002)保護(hù)的性能枸杞多糖對(duì)時(shí)間和高熱誘導(dǎo)損傷。民族藥物學(xué).82期.169一l75頁.4Mitsuhas

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