不同理化因子組合對長春花懸浮培養(yǎng)的研究

1、不同理化因子組合對長春花懸浮培養(yǎng)的研究摘 要：實(shí)驗(yàn)了不同種類、不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)組合和其他四種理化因子對長春花懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長的。以前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：單因子以 2，畢業(yè)論文開題報(bào)告4-D效果最好。其中以2，4-D的最佳濃度為0.5mg/L。而本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明:組合因子比單因子更有利于細(xì)胞的生長，以0.5mg/L NAA+0.5mg/L 2,4-D+2.0mg/L 6-BA為最佳。在其它的四種理化因子中，1/2MS、MS和B5培養(yǎng)基有利于細(xì)胞的生長。蔗糖的最佳濃度為30g/L；葡萄糖在研究范圍內(nèi)隨著濃度的增加，生長速度也在增加。最適于長春花的PH值為5.0-5.4。關(guān)鍵詞：長春花 細(xì)胞

2、懸浮培養(yǎng) 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 理化因子一、引言長春花（Catharanthus roseus(L.) G. Don）屬于夾竹桃科（Apocynaceae）長春花屬1。為多年生草本。原產(chǎn)于非洲東南部，現(xiàn)在我國各地均有栽培。長春花用途廣泛，主要含具有抗腫瘤作用的生物堿長春堿和長春新堿等2。長春花組織和細(xì)胞培養(yǎng)的研究已經(jīng)有很多年，多數(shù)于大量細(xì)胞生產(chǎn)和植物的再生，以成分、提取為主，應(yīng)用于次生代謝產(chǎn)物的提取卻很少3。長春花的懸浮培養(yǎng)的就是植物細(xì)胞化的必經(jīng)步驟和固體培養(yǎng)基相比，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)具有繁殖速度快、能大規(guī)模培養(yǎng)和提供大量均勻一致的植物細(xì)胞培養(yǎng)物的特點(diǎn)。然而長春花細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)技術(shù)并不完善，在國內(nèi)外很少

3、有此類報(bào)道。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)受到許多外界條件的影響。如激素、溫度、光照、營養(yǎng)、PH值等。本文就這方面選取了不同的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)種類、濃度組合以及其他的四種理化因子來培養(yǎng)懸浮細(xì)胞，以便獲得細(xì)胞快速增殖的最佳培養(yǎng)條件。 二、材料與1材料長春花（Catharanthus roseus(L.) G. Don）取自中科院武漢植物園2愈傷組織的誘導(dǎo)取春天4月份的長春花幼嫩的葉片，為誘導(dǎo)及大量繁殖，必須對外植體進(jìn)行挑選4，用自來水沖洗1-2個(gè)小時(shí)，濾紙吸干，用75%的酒精侵泡30S后，用0.1%的升汞消毒8min，無菌水沖洗數(shù)遍。切成0.5cm0.5cm 的小塊。接種于含0.5mg/L NAA+0.5mg/L

4、 2,4-D+2.0mg/L 6-BA（本文所用的生長調(diào)節(jié)劑購于上海，配成1mg/mL的母液）、瓊脂7g/L、蔗糖30g/L的MS固體培養(yǎng)基上（PH=5.8，高壓滅菌）在光強(qiáng)為40mol/ms 12-14h/d.溫度為252條件先誘導(dǎo)5。3愈傷組織的篩選及細(xì)胞懸浮系的建立6誘導(dǎo)出的愈傷組織接種于含50ml固體培養(yǎng)基的150ml的三角瓶中，每瓶的接種量約3g。愈傷組織每25天繼代一次。經(jīng)3-5次繼代后，選擇生長均一、質(zhì)地疏松、分散性好的愈傷組織轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中。每150ml三角瓶中分裝40ml的液體培養(yǎng)基（同上的固體培養(yǎng)基去掉瓊脂，以下的實(shí)驗(yàn)沒有特別說明的都是該種培養(yǎng)基）。每次接種量約為2g。懸

5、浮培養(yǎng)采用旋轉(zhuǎn)式搖床，轉(zhuǎn)速為120r/min。置于光照下培養(yǎng)。4細(xì)胞干重的測定細(xì)胞懸浮周期為25天。培養(yǎng)結(jié)束后，經(jīng)減壓過濾后測其鮮重。然后收集培養(yǎng)物置于60烘箱中烘干至恒重稱其干重。換算成每天每升培養(yǎng)基增加的細(xì)胞干重毫克數(shù)，即mg/Ld.表示細(xì)胞的生長速度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取其平均值結(jié)果。 三、結(jié)果與討論1激素組合對長春花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生長的效應(yīng)（1） 2，4-D和6-BA組合對培養(yǎng)細(xì)胞生長的效應(yīng)表4 2，4-D和NAA組合對培養(yǎng)細(xì)胞生長的效應(yīng)2，4-D（0.5）+6-BA x（mg/L）0.050.10.20.51.02.05.0干重增加（mg/L）23525008820010109609558

6、324000生長速度（mg/Ld）95201328405244234160由表4可以看出，2，4-D和6-BA組合使用比單獨(dú)一種更有利于細(xì)胞的生長。當(dāng)組合中6-BA在0.05-0.5范圍內(nèi)，細(xì)胞生長速度隨著濃度的增加而增加。在0.5mg/L2，4-D+0.5mg/L6-BA時(shí)，細(xì)胞的生長速度最快。而在6-BA在0.5-2.0mg/L時(shí)，隨著 6-BA的增加，其生長速度不斷地下降。（2）2，4-D、NAA和6-BA組合對培養(yǎng)細(xì)胞生長的效應(yīng)表5 2，4-D、NAA和6-BA組合對培養(yǎng)細(xì)胞生長的效應(yīng)2，4-D（0.5）+NAA（0.5）+ 6-BAx（mg/L）0.050.10.20.51.02.0

7、5.0干重增加（mg/L）25034313653292059826102948653生長速度（mg/Ld）101173262369394412347由表5可以看出：2，4-D、NAA和6-BA三種激素組合時(shí)，更有利于細(xì)胞培養(yǎng)的生長，且在研究范圍內(nèi)較單因子有著更明顯的效果。在研究范圍內(nèi)的最佳濃度為0.5mg/L NAA+0.5mg/L 2,4-D+2.0mg/L 6-BA。2其他理化因子對長春花懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長的效應(yīng)（1）不同種類培養(yǎng)基對對培養(yǎng)細(xì)胞生長的效應(yīng)在長春花細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)中，分別采取了1/4MS、1/2MS、MS、B5、White、N6六種不同的培養(yǎng)基6，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：表6 不同種類培養(yǎng)

8、基對對培養(yǎng)細(xì)胞生長的效應(yīng)培 養(yǎng) 基 種 類1/4MS1/2MSMSB5WhiteN6干重增加（mg/L）97761252610294113288310死亡生長速度（mg/Ld）392501412454333由表6可以看出1/2MS、MS和B5培養(yǎng)基對細(xì)胞的生長比較適合。而在N6培養(yǎng)基中細(xì)胞全部死亡。在不同培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長的速度情況不同是由于作為氮源的狀態(tài)不同，含量不同所造成的。（2）不同蔗糖濃度對細(xì)胞生長的效應(yīng)表7 不同蔗糖濃度對細(xì)胞生長的效應(yīng)不同蔗糖濃度（g/L）01020304050干重增加（mg/L）死亡258752781029497757829生長速度（mg/Ld）104212412

9、391314由表7可以看出，在MS培養(yǎng)基中，隨著蔗糖濃度的升高，生長速度逐漸增大，說明在低濃度時(shí)，糖是細(xì)胞生長的限制性基質(zhì)7。甘煥遠(yuǎn)等8在前人和自己的工作的基礎(chǔ)上提出了培養(yǎng)基中蔗糖常常是使培養(yǎng)物生長達(dá)到最高的碳源。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)隨著糖濃度的增加會(huì)導(dǎo)致干重的增加，而細(xì)胞數(shù)量并不顯著增加9。實(shí)驗(yàn)也證明了蔗糖的濃度為30g/L時(shí)，細(xì)胞生長最快。低于或高于此濃度，其細(xì)胞生長速度都將下降。 （3）不同葡萄糖濃度對細(xì)胞生長的效應(yīng)表8 不同葡萄糖濃度對細(xì)胞生長的效應(yīng)不同葡萄糖濃度（g/L）01020304050干重增加（mg/L）死亡21504415604072818801生長速度（mg/Ld）87177242292353由表8和上面兩個(gè)示意圖可以看出，在MS培養(yǎng)基