經(jīng)前舒對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞ERβ蛋白和基因表達(dá)的影響

1、經(jīng)前舒對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞ER蛋白和基因表達(dá)的影響    【摘要】  目的觀察經(jīng)前舒顆粒對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元ER蛋白和基因表達(dá)的影響，探討經(jīng)前舒顆粒治療經(jīng)前期綜合征（PMS）肝氣郁證的作用機(jī)制。方法 以束縛造模法復(fù)制PMS肝氣郁證大鼠模型，給藥組給予調(diào)肝方藥經(jīng)前舒顆粒，模型組給予滅菌飲用水，并設(shè)不造模正常組，取各處理組血清，對(duì)體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)；采用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（Western blot，WB）和半定量RT-PCR技術(shù)分別對(duì)各組細(xì)胞ER蛋白和基因表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果模型組血清能顯著升高大鼠海馬神經(jīng)元ER蛋白和基因表達(dá)水平，wes

2、tern blot 和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果均顯示經(jīng)前舒顆粒含藥血清能顯著改善PMS肝氣郁證模型血清干預(yù)的大鼠海馬神經(jīng)元ER蛋白和基因表達(dá)水平異常升高的狀況。結(jié)論大鼠海馬神經(jīng)元中的ER是調(diào)肝方藥經(jīng)前舒顆粒的作用靶點(diǎn)之一，經(jīng)前舒顆粒可能通過降低ER蛋白和基因的表達(dá)水平而發(fā)揮治療作用。 【關(guān)鍵詞】  PMS肝氣郁證； 含藥血清； 神經(jīng)元細(xì)胞； 雌激素受體Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of Jingqianshu granule on ER protein and gene expression in rat hippocampal

3、neurons and the pathogenesis of PMS with liver-"qi" depression. MethodsPrepare Jingqianshu medicated serum intervene and in  vitro culture hippocampal primary neurons ;then detect the variety of ER protein and gene expression with WB and RT-PCR respectively. ResultsThe results of WB a

4、nd PT-PCR revealed that Jingqianshu granule could improve the abnormal conditions of the expression.ConclusionThe Jingqianshu granule can down-regulate the ER protein and gene expression levels in neurons, which may be one of the mechanism to treat PMS with liver-"qi" depression.Key words：

5、 Liver-"qi" depression;  PMS;  Medicated serum;  Neural cells;  Estradiol Receptor beta   經(jīng)前期綜合征（premenstrual syndrome，PMS）肝氣郁證是指嚴(yán)重影響正常生活的一組與月經(jīng)周期密切相關(guān)、可預(yù)見的經(jīng)前癥狀，其主要癥狀為易激惹、焦慮、抑郁等情緒不穩(wěn)定的主觀癥狀，其特點(diǎn)為黃體期（月經(jīng)周期最后兩周內(nèi)）出現(xiàn)癥狀，月經(jīng)來潮后癥狀自行消失1，2。PMS肝氣郁證是PMS的主要亞型，是肝疏泄不及的表現(xiàn)。經(jīng)前舒顆粒含白芍、

6、當(dāng)歸、柴胡、白術(shù)、丹皮、香附等中藥組分具養(yǎng)肝解郁。理氣消脹功效，可顯著提高PMS肝氣郁證臨床治愈率。本實(shí)驗(yàn)制備大鼠含藥血清，并通過Western blot和半定量RT-PCR技術(shù)研究了經(jīng)前舒顆粒含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元ER蛋白和基因表達(dá)的影響。1  材料與儀器1.1  藥物經(jīng)前舒顆粒（秦皇島市山海關(guān)制藥廠生產(chǎn) 批號(hào)：Z20053087），灌胃給藥，給藥量為4.8 g/kg（相當(dāng)于人臨床8倍劑量）。1.2  動(dòng)物健康SD雌性大鼠，體質(zhì)量180220 g，36只;新生SD大鼠（24 h）,均由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）2005

7、0015。1.3  試劑Neurobasal、B27、L-Glutamine（Gibco公司提供)；Fetal Bovine Serum、Poly-D-lysine（Sigma公司提供）；Rabbit polyclonal to ER IgG（ab3576），堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗鼠IgG（sc-2005）（Santa Cruz公司）；Donkey polyclonal to Rabbit IgG (HRP)(ab16284)， HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG（SB100-晶美生物）；RNAisoTMPlus、Taq HS（不含dNTP Mixture）、Rnase Inhibitor、

8、dNTP Mixture、RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶生物工程大連有限公司提供）；引物：ER上游F5-TCA CCG TCG AGC CTT AGT TC -3下游R5-TCT GCA TAG AGG AGC GAT GA -3（286bp）；內(nèi)參-actin 上游F5-AGG GAA ATC GTG CGT GAC-3下游R5- CAA AGA AAG GGT GTA AAA CG -3（552bp）（濟(jì)南博亞生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成）。1.4  儀器CO2培養(yǎng)箱（上海力新有限公司）；倒置顯微鏡（中國重慶光電有限公司）；TECAN酶標(biāo)儀（上海麥莎生物科技有限公司）；721分光光度計(jì)（上

9、海精密儀器儀表有限公司）；凝膠成像分析儀（上海復(fù)日科技有限公司）；PCR擴(kuò)增儀（TAKARA）。2  方法2.1  含藥血清的制備篩選動(dòng)情周期規(guī)則的SD大鼠36只進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，并隨機(jī)分為正常組，模型組和給藥組，每組12只，飼養(yǎng)于晝夜顛倒環(huán)境。根據(jù)文獻(xiàn)方法3并加以改進(jìn)，將擬造模大鼠（模型組和給藥組）前足與對(duì)側(cè)后足用無菌紗布捆縛，妨礙其自由活動(dòng)，以大鼠稍能活動(dòng)、取食為度。造模同時(shí)給藥組大鼠給予經(jīng)前舒顆粒（1 ml/100 g體質(zhì)量，相當(dāng)于人臨床8倍劑量4）。模型組、正常組大鼠給予相同體積的滅菌飲用水，1次/d，連續(xù)5 d。造模完畢斷頭取血，離心，收集血清，-70保存。用前56、30

10、 min滅活，0.45 m微孔濾膜濾菌。2.2  大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)及細(xì)胞相對(duì)活力測(cè)定參考文獻(xiàn)方法5，取新生SD大鼠大腦海馬區(qū)進(jìn)行神經(jīng)元體外原代培養(yǎng)，MTT檢測(cè)神經(jīng)元存活率。將細(xì)胞接種在96孔板中，種植濃度1×106/ml，置于37、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24，48 h后全量換液。細(xì)胞分3組，分別加入正常組大鼠血清、 模型組大鼠血清、 給藥組大鼠血清，使其最終濃度為10%（V/V）。細(xì)胞培養(yǎng)72h后，每孔加入20 l 0.5%MTT溶液；繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去上清，每孔加入150 l DMSO，置培養(yǎng)箱15 min；用酶標(biāo)儀于490 nm波長測(cè)定各孔吸光度值。細(xì)胞

11、培養(yǎng)分組及加入大鼠血清（同前），繼續(xù)培養(yǎng)24 h，消化收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，PBS 洗滌，-70放置備用。2.3  蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)（Western blot）檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元中ER蛋白表達(dá)水平取細(xì)胞樣品提蛋白， 檢測(cè)蛋白含量。進(jìn)行SDS-PAGE, 用水浴式電轉(zhuǎn)儀將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至NC膜上(1 h)，用含5脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，然后分別與一抗于4 孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，BeyoECL Plus A液和B液顯色，曝光，對(duì)ER表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。顯色過的NC膜用洗脫液室溫洗脫15 min，再用-Actin抗體染色并檢測(cè)（檢測(cè)均采用Smartview生物電泳圖像分

12、析系統(tǒng)）。2.4  半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元中ER mRNA的表達(dá)水平根據(jù)RNAisoTMPlus總RNA提取試劑盒操作說明提取總RNA,紫外分光光度儀檢測(cè)純度，A260/A2801.8，反轉(zhuǎn)錄（RT）按照Promega的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行操作，PCR擴(kuò)增條件為：95，3 min，預(yù)變性；94，30 s，變性； ER 62，內(nèi)參61.8，45 s,退火；72，1 min，延伸；再72，7 min，延伸。循環(huán)參數(shù)為：ER為33，內(nèi)參為25。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用Smartview生物電泳圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度掃描。2.5  統(tǒng)計(jì)方法利用SPSS 1

13、1.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD法檢驗(yàn)以統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均用±s表示，顯著性水平為P<0.05。3  結(jié)果3.1  經(jīng)前舒顆粒含藥血清對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響結(jié)果見表1。結(jié)果表明給藥24 h后，與正常組相比，模型組神經(jīng)元MTT值顯著增加（P<0.05）；給藥48 h后，與模型組相比，給藥組神經(jīng)元MTT值顯著增加（P<0.05）。表1  不同實(shí)驗(yàn)組血清處理24h、48h后對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞相對(duì)活力影響（略）3.2  經(jīng)前舒顆粒含藥血清對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元ER蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖1及表2。結(jié)果顯示，與正常組相比，模

14、型組大鼠血清干預(yù)的大鼠海馬神經(jīng)元ER的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），調(diào)肝方藥經(jīng)前舒顆粒含藥血清的干預(yù)能顯著改變ER蛋白表達(dá)水平異常升高的狀態(tài)。表2  大鼠海馬神經(jīng)元ER與內(nèi)參相對(duì)光密度（略）3.3  經(jīng)前舒顆粒含藥血清對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元ER mRNA表達(dá)的影響結(jié)果見圖2及表3。結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠血清干預(yù)的大鼠海馬神經(jīng)元ER mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），調(diào)肝方藥經(jīng)前舒顆粒含藥血清的干預(yù)能顯著改變ER mRNA表達(dá)水平異常升高的狀態(tài)。表3  大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞ERmRNA擴(kuò)增產(chǎn)物與內(nèi)參相對(duì)光密度（略）4  討論

15、   雌激素受體（ER）是核受體超家族的成員，是一類配體調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，存在ER和ER兩種亞型，ER在體內(nèi)分布廣泛，在許多組織和細(xì)胞中都有分布6。研究發(fā)現(xiàn)在腦的許多部位如視覺前區(qū)、大腦皮質(zhì)、丘腦、垂體和邊緣系統(tǒng)等都存在著雌激素受體，在腦功能中起重要作用710,受體主要分布于大腦皮層、海馬處，與記憶、認(rèn)知和行為有關(guān)10，11。海馬是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)情緒、學(xué)習(xí)和記憶、行為等的調(diào)節(jié)起重要作用，也是應(yīng)激反應(yīng)的高位調(diào)節(jié)中樞，慢性應(yīng)激可損害海馬，引起其結(jié)構(gòu)和功能的變化12，13。抑郁癥患者海馬體積萎縮可能與出現(xiàn)認(rèn)知，情感等方面的癥狀有關(guān)14。因此，海馬是調(diào)節(jié)情緒的重要腦區(qū)，也

16、是應(yīng)激損傷的主要易感部位。    本實(shí)驗(yàn)采用束縛法制作PMS肝氣郁證大鼠模型，在檢測(cè)方面利用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（Western blot，WB）和半定量的RT-PCR技術(shù)對(duì)大鼠海馬原代神經(jīng)元中的雌激素受體蛋白和mRNA表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，利用ER蛋白和mRNA表達(dá)量的變化來探討雌激素受體與PMS肝氣郁證的關(guān)系。結(jié)果表明，與正常組細(xì)胞相比，模型大鼠血清干預(yù)的海馬神經(jīng)元ER蛋白和mRNA表達(dá)均顯著升高（P<0.05），這說明PMS肝氣郁證模型大鼠海馬神經(jīng)元ER蛋白和mRNA表達(dá)量顯著性上調(diào)可能是導(dǎo)致經(jīng)前抑郁的重要病因之一，此病證與腦區(qū)ER蛋白和mRNA表達(dá)量的變化密切相關(guān)

17、，這一發(fā)現(xiàn)無疑為我們研究經(jīng)前抑郁的病因提供客觀理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。而與模型組細(xì)胞相比，調(diào)肝方藥經(jīng)前舒顆粒含藥血清的干預(yù)能顯著改變ER蛋白和mRNA表達(dá)水平異常升高的狀態(tài)，這提示我們經(jīng)前舒顆粒治療PMS肝氣郁證與調(diào)節(jié)中樞海馬神經(jīng)元中ER蛋白和mRNA表達(dá)水平密切相關(guān)，雖然目前其具體作用機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步研究，但這為經(jīng)前期綜合征肝氣郁證的治療提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1ACOG Practice Bulletin. Clinical managementguidelines for obstetrician-gynecologistsJ. Premenstrual synd

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