3、翻譯起始因子

1、分子機制研究套路（三）翻譯起始因子課題：受體 A 蛋白與真核翻譯起始因子B 相互作用的分子機制及功能研究1概念介紹：眾所周知， 蛋白質(zhì)是具有內(nèi)在結(jié)構(gòu)并能夠發(fā)揮眾多功能的一類生物大分子。蛋白質(zhì)通常由二十種氨基酸通過不同的搭配組成，每一個蛋白質(zhì)都是由一條或多條氨基酸分子形成的膚鏈組成。而多膚鏈中的氨基酸是由其對應(yīng)的信使RNA(messenger RNA, mRNA)分子中的核酸基序決定的。 mRNA 分子要將自身攜帶的信息轉(zhuǎn)化為不同功能的蛋白質(zhì)，就必須通過翻譯過程。整個翻譯過程分為三步：翻譯起始， 翻譯延伸和翻譯終止。每一步過程都需要有許多蛋白質(zhì)的參與，其中翻譯的起始是整個過程的開端，意義重大。翻

2、譯起始過程可被分為三步：首先，40S 小亞基與翻譯起始因子結(jié)合，在翻譯起始因子的幫助下與 mRNA 模板結(jié)合； 然后，在翻譯起始因子和GTP 的幫助下， Met-tRNA 進入小亞基，tRNA 上的反密碼子與mRNA 上的起始密碼子配對；最后，由tRNA ， mRNA ，翻譯起始因子組成的小亞基復(fù)合物與大亞基結(jié)合，伴隨著GTP 的水解，并釋放出翻譯起始因子。真核翻譯起始因子(eukaryotic initiation factor ，eIF)，是指參與和幫助真核細胞翻譯起始這一過程的蛋白質(zhì)。與原核翻譯起始因子只有三種(IF1 、IF2 、IF3) 相比，真核翻譯起始因子種類多且復(fù)雜。通過這些真

3、核翻譯起始因子之間以及不同的真核翻譯起始因子與其它細胞器或大分子 (核糖體， mRNA ，起始tRNA) 之間的相互作用，來完成真核生物的翻譯起始。對于真核生物來說，其翻譯起始過程更多的依賴于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)與RNA 之間的相互作用。除了參與真核翻譯起始進程之外，大多數(shù)真核翻譯起始因子還有其他一些功能。比如參與細胞生長和細胞周期的調(diào)控，與某些疾病的發(fā)生相關(guān)等。2示意圖：3研究思路：3.1受體 A 與翻譯起始因子B 的相互作用 .33.1.1酵母雙雜交證實受體 A-ICD （ intracellular domain ）與翻譯起始因子 B 相互作用 .33.1.2GST pull -do

4、wn 驗證受體 A-ICD 與翻譯起始因子B 的相互作用.3一） GST-翻譯起始因子 B 與 HA- 受體 A-ICD的相互作用 .3二） GST-受體 A-ICD 與 Myc- 翻譯起始因子B 的相互作用 .43.1.3體外翻譯系統(tǒng)證實受體A-ICD 與翻譯起始因子B 在體外能直接相互作用 .43.1.4免疫共沉淀 (Co-IP) 驗證受體 A-ICD 與翻譯起始因子 B 的相互作用 .53.2受體 A-ICD與翻譯起始因子B 相互作用的定位.53.2.1翻譯起始因子 B 通過其 N 端與受體 A-ICD 相互作用 .5GST pull-down實驗證實翻譯起始因子 B 通過其 N 端與受

5、體 A-ICD相互作用： .53.2.2受體 A-ICD 通過 TK 結(jié)構(gòu)域與翻譯起始因子B 相互作用 .6GST pull-down實驗證實受體A-ICD 通過 TK 結(jié)構(gòu)域與翻譯起始因子B 相互作用： .63.3受體 A-ICD與翻譯起始因子B 在細胞內(nèi)的共定位.73.4全長受體 A 與翻譯起始因子B 的相互作用 .73.4.1GST pull-down 實驗證實受體A 與翻譯起始因子B 能在體外結(jié)合 .73.4.2免疫共沉淀 (Co-IP) 驗證受體A 與翻譯起始因子B 的相互作用 .83.5受體 A 對 5端具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的pcDNA3.1(+)-SL-LUC 質(zhì)粒翻譯的影響 .83.5

6、.1構(gòu)建 pcDNA3.1(+)-LUC載體 .83.5.2 受體 A 對 5'端具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的pcDNA3.1(+)-SL-LUC質(zhì)粒翻譯的影響. 83.1 受體 A 與翻譯起始因子B 的相互作用3.1.1 酵母雙雜交 證實受體 A-ICD （ intra cellular domain ）與翻譯起始因子B 相互作用受體 A-ICD 和翻譯起始因子B 蛋白的自激活檢測：將質(zhì)粒 pAS2-l- 受體 A-ICD 與 pACT2- 翻譯起始因子B 分別轉(zhuǎn)化酵母宿主菌Y190 ，涂布于SD/-Trp/-His+3-AT和 SD/-Leu/-His+3-AT固體培養(yǎng)基上，7 天后，未見有克隆

7、生長。結(jié)果表明兩種載體表達的融合蛋白都不能自主激活報告基因。受體 A-ICD 與翻譯起始因子B 在酵母體系中相互作用的驗證：利用氯化裡轉(zhuǎn)化方法，將 PAS2-1-受體 A-ICD 與 pACT2- 翻譯起始因子B 兩種載體同時轉(zhuǎn)化酵母宿主菌Y190 ，涂布于 SD/-Trp/-Leu/-His+3-AT(25mM)固體培養(yǎng)基上， 7 天后有陽性克隆出現(xiàn)，直徑大于2 mm，呈白色，苗壯生長。轉(zhuǎn)接到新鮮的SD/-Trp/-Leu/-His+3-AT(25 mM)固體培養(yǎng)基上，生長3-4 天后，檢測 -半乳糖苷酶活性。結(jié)果表明共轉(zhuǎn)PAS2-1-受體 A-ICD和 pACT2- 翻譯起始因子B 質(zhì)粒的

8、酵母菌株以及陽性對照菌株的檢測結(jié)果為陽性(酵母裂解產(chǎn)物變藍 )，對照組結(jié)果均為陰性，表明在酵母體內(nèi)受體A-ICD 與翻譯起始因子B 能夠相互作用。3.1.2GST pull -down驗證受體 A-ICD 與翻譯起始因子B 的相互作用一） GST- 翻譯起始因子B 與 HA- 受體 A-ICD的相互作用重組蛋白 GST-翻譯起始因子B 在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達及純化：將重組質(zhì)粒pGEX-6P-l- 翻譯起始因子B 及空載體 pGEX-6P-l 各自轉(zhuǎn)化菌株BL21 ，0.5 mmol/L的 IPTG 誘導(dǎo)16 h 后，超聲破碎菌體，將誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的蛋白樣品以及經(jīng)GlutathioneSepha

9、rose 4B 介質(zhì)純化的蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE 分離， 考馬斯亮藍染色，脫色。含有重組質(zhì)粒 pGEX-6P-l- 翻譯起始因子B 的宿主菌經(jīng)超聲破碎的裂解液上清在kDa 位置略上處出現(xiàn)誘導(dǎo)表達帶， 與預(yù)期分子量基本一致，并且經(jīng) Glutathione Sepharose 4B 介質(zhì)純化后， 可得到高純度的 融合蛋白GST-翻譯起始因子B ；而含 pGEX-6P-l 空載體的宿主菌裂解液上清中僅出現(xiàn)一條約26 kDa 的誘導(dǎo)表達條帶，經(jīng)Glutathione Sepharose 4B 介質(zhì)純化后，也可得到高純度的 GST 蛋白。GST pull-down 實驗證實 受體 A-ICD 與翻譯

10、起始因子B 能在體外結(jié)合：使用 IPTG 誘導(dǎo)含有空載體PGEX-6P-1 或重組質(zhì)粒pGEX-6P-l- 翻譯起始因子B 的大腸桿菌BL21 ，表達 GST 蛋白和 融合蛋白 GST-翻譯起始因子B，利用Glutathione Sepharose 4B 親和層析柱純化GST 和 GST-翻譯起始因子B。將重組質(zhì)粒pCMV-HA- 受體 AICD瞬時轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞，收集并裂解細胞，獲得含有融合蛋白 HA- 受體 AICD 的細胞總蛋白。將經(jīng)過預(yù)清除的細胞總蛋白與結(jié)合有GST 或 GST-翻譯起始因子B 蛋白的 GlutathioneSepharose 4B 于 4°C 溫育

11、過夜。 樣品處理后， 進行 SDS-PAGE，而后進行Western Blot 分析。以 anti-HA 單抗檢測HA- 受體 A-ICD ，以考馬斯亮藍染色檢測純化的GST 和 GST-翻譯起始因子 B，上樣量為pull-down 實驗蛋白用量的1/20。結(jié)果發(fā)現(xiàn)純化的GST-翻譯起始因子B泳道中有一條分子量為kDa 左右的特異性條帶，其大小與HEK293T 細胞裂解液中檢測到的 HA- 受體 A-ICD 致， 而在 GST 泳道中則無任何條帶，該結(jié)果表明純化的GST-翻譯起始因子 B 能結(jié)合 HA- 受體 A-ICD ，而純化的GST 則不能結(jié)合HA- 受體 A-ICD ，由此表明 受體A

12、-ICD 與翻譯起始因子B 在體外能進行特異性結(jié)合。二） GST- 受體 A-ICD與 Myc- 翻譯起始因子B 的相互作用重組蛋白 GST-受體 A-ICD 的誘導(dǎo)表達及純化GST pull-down 實驗證實 受體 A-ICD 與翻譯起始因子B 能在體外結(jié)合注釋： 具體操作步驟同一） ，目的是為了雙向驗證2 個蛋白可發(fā)生相互作用。3.1.3 體外翻譯系統(tǒng) 證實 受體 A-ICD與翻譯起始因子B 在體外能直接相互作用使用 體外翻譯系統(tǒng)TNT Quick Coupled Transcription /Translation Systems表達 His- 受體 A-ICD ；在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達

13、GST 和 GST-翻譯起始因子B ，而后將結(jié)合有GST 或 GST-翻譯起始因子 B 蛋白的 Glutathione Sepharose 4B 與 His- 受體 A-ICD共同溫育。 細胞裂解液洗滌3次后，加入2XSDS 上樣緩沖液，沸水中加熱5min，離心收集上清。進行SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)印到銷酸纖維素膜上進行Western Blot 分析。以 anti- 受體 A 檢測 His- 受體 A-ICD ，以考馬斯亮藍染色檢測純化的GST 和 GST-翻譯起始因子B，上樣量為pull-down 實驗蛋白用量的 1/20。結(jié)果顯示： 純化的 GST-翻譯起始因子 B 能結(jié)合 His- 受

14、體 A-ICD ，而純化的 GST 不能結(jié)合 His- 受體 A-ICD ，由此表明 受體 A-ICD 與翻譯起始因子 B 在體外能直接特異性結(jié)合。3.1.4 免疫共沉淀 (Co-IP) 驗證 受體 A-ICD與翻譯起始因子B 的相互作用為研究 受體A-ICD與翻譯起始因子B 在體內(nèi) 的相互作，將pCMV-HA- 受體A-ICD和pCMV-Myc- 翻譯起始因子B 共轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞，作為實驗組；同時將pCMV-HA- 受體A-ICD 和 pCMV-Myc轉(zhuǎn)染 HEK293T 細胞作為對照組，轉(zhuǎn)染24 h 后收獲細胞。將裂解后的細胞總蛋白中加入anti-c-Myc 溫育后， prote

15、in G 捕獲免疫復(fù)合物。SDS-PAGE 電泳后， 將蛋白轉(zhuǎn)印到銷酸纖維素膜上進行Western Blot 分析。 anti-HA 雜交后，可以檢測到受體 A-ICD的存在，而對照組則檢測不到。 反之，將裂解后的細胞總蛋白中加入anti-HA溫育，anti-c-Myc雜交同樣也可以檢測到 翻譯起始因子B，而對照組則檢測不到。兩個方向的免疫共沉淀結(jié)果表明，在細胞內(nèi) 受體 A-ICD 與翻譯起始因子 B 可以相互作用。3.2 受體 A-ICD 與翻譯起始因子B 相互作用的定位3.2.1 翻譯起始因子 B 通過其 N 端與受體 A-ICD 相互作用GST pull-down 實驗證實 翻譯起始因子

16、B 通過其 N 端與受體 A-ICD 相互作用：表達 GST 蛋白、 GST-翻譯起始因子B-NTD （ N 端截短體）和翻譯起始因子B-CTD （C 端截短體），利用Glutathione Sepharose 4B 親和層析柱純化GST、 GST-翻譯起始因子B-NTD和 GST-翻譯起始因子B-CTD 。將重組質(zhì)粒pCMV-HA- 受體 A-ICD 瞬時轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞 ,收集并裂解細胞，獲得含有融合蛋白HA- 受體 A-ICD 的細胞總蛋白。將經(jīng)過預(yù)清除的細胞總蛋白與結(jié)合有GST、 GST-翻譯起始因子B-NTD或 GST-翻譯起始因子 B -CTD 蛋白的 Glutathion

17、e Sepharose 4B 于 4°C 溫育過夜， 樣品處理后， 進行 Western Blot分析。以 anti-HA 單抗檢測HA- 受體 A-ICD ，以考馬斯亮藍染色檢測純化的GST 和 GST-翻譯起始因子B-NTD 或 GST-翻譯起始因子B-CTD ，上樣量為 pull-down 實驗蛋白用量的1/20 。結(jié)果顯示只有純化的 GST-翻譯起始因子 B-NTD泳道中有一條分子量與HEK293T 細胞裂解液中檢測到的HA- 受體 A-ICD 致的條帶，而在GST 和 GST-翻譯起始因子 B-CTD 泳道中則無任何條帶，所以該結(jié)果表明純化的GST-翻譯起始因子B-NTD

18、能結(jié)合 HA- 受體 AICD ，而純化的 GST 和 GST-翻譯起始因子B-CTD 則不能結(jié)合HA- 受體 AICD ，由此表明 翻譯起始因子 B 通過其 N 端與受體 A-ICD相互作用。3.2.2 受體 A-ICD 通過 TK 結(jié)構(gòu)域與 翻譯起始因子B 相互作用GST pull-down實驗證實 受體 A-ICD通過 TK 結(jié)構(gòu)域與 翻譯起始因子B 相互作用：大量表達GST 、 GST-JM 、 GST-ATP、 GST-TK ，利用 Glutathione Sepharose 4B親和層析柱進行純化。將重組質(zhì)粒pCMV-Myc- 翻譯起始因子B 瞬時轉(zhuǎn)染HEIC293T 細胞，收集并

19、裂解細胞，獲得含有融合蛋白HA- 受體 A-ICD的細胞總蛋白。將經(jīng)過預(yù)清除的細胞總蛋白與結(jié)合有 GST、GST-JM 、GST-ATP、GST-TK 蛋白的 Glutathione Sepharose 4B 于 4°C 溫育過夜，樣品處理后， 進行 Western Blot 分析。以 anti-c-Myc 檢測 Myc- 翻譯起始因子B，以考馬斯亮藍染色檢測純化的GST、 GST-JM 、 GST-ATP、 GST-TK ，上樣量為pull-down 實驗蛋白用量的 1/20。結(jié)果顯示僅純化的GST-TK 泳道中有一條分子量與HEK293T 細胞裂解液中檢測到的 Myc- 翻譯起始

20、因子B致的條帶，而在GST 泳道、 GST-JM 泳道、 GST-ATP 泳道中，則無任何條帶， 所以該結(jié)果表明純化的GST-TK 能結(jié)合 Myc- 翻譯起始因子B，而純化的GST 、GST-JM、GST-ATP 則不能結(jié)合Myc- 翻譯起始因子B，由此表明受體A-ICD 通過 TK 結(jié)構(gòu)域與翻譯起始因子B 相互作用。注釋 ： A-ICD表達 A 的 434-790 氨基酸； JM 表達 A 的 434-509氨基酸； ATP 表達 A 的434-538 氨基酸； TK 表達 A 的 510-790氨基酸。3.3 受體 A-ICD與翻譯起始因子B 在細胞內(nèi)的共定位為了證實 受體 A-ICD 與

21、翻譯起始因子 B 在細胞內(nèi)能否共定位， 構(gòu)建以下兩個真核表達載體:pECFP-N1- 受體A-ICD 和 pEYFP-N1- 翻譯起始因子B 。將 pECFP-N1- 受體 A-ICD和pEYFP-N1- 翻譯起始因子 B 共同轉(zhuǎn)染 HEK293T 細胞，轉(zhuǎn)染 48 h 后，激光共聚焦顯微鏡下觀察。受體 A-ICD-CFP 呈青色，在 細胞質(zhì) 中表達； 翻譯起始因子 B-YFP 呈黃色 ，也在 細胞質(zhì)中表達，兩者在細胞質(zhì)內(nèi)疊加呈綠色 。說明 受體 A-ICD 與翻譯起始因子 B 能在細胞中共定位。3.4 全長 受體 A 與翻譯起始因子B 的相互作用3.4.1GST pull-down 實驗證實

22、 受體 A 與翻譯起始因子B 能在體外結(jié)合使用 IPTG 誘導(dǎo)含有空載體 PGEX-6P-1或重組質(zhì)粒 pGEX-6P-l- 翻譯起始因子 B 的大腸桿菌BL21 ，表達 GST 蛋白和融合蛋白GST-翻譯起始因子B ，利用 Glutathione Sepharose 4B 親和層析柱純化 GST 和 GST-翻譯起始因子B。將 重組質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)- 受體 A 轉(zhuǎn)染 HEK293T細胞，收集并裂解細胞，獲得含有受體 A 的細胞總蛋白。將經(jīng)過預(yù)清除的細胞總蛋白與結(jié)合有GST 或 GST-翻譯起始因子B 蛋白的 GlutathioneSepharose 4B 于 4°C 溫

23、育過夜。 樣品處理后， 進行 SDS-PAGE，而后進行Western Blot 分析。以 anti-受體 A 抗體檢測 受體 A ，以考馬斯亮藍染色檢測純化的GST 和 GST-翻譯起始因子B ，上樣量為 GST pull-down 實驗蛋白用量的1/20。結(jié)果表明純化的GST-翻譯起始因子B 泳道中有一條分子量與HEK293T 細胞裂解液中檢測到的受體 A 致的條帶，而在GST 泳道中則無任何條帶，所以該結(jié)果表明純化的GST-翻譯起始因子B 能結(jié)合 受體 A ，而純化的GST則不能結(jié)合 受體 A，由此表明 受體 A 與翻譯起始因子B 在體外能進行特異性結(jié)合。3.4.2 免疫共沉淀 (Co-IP) 驗證 受體 A 與翻譯起始因子B 的相互作用將 pcDNA3.1(+)- 受體 A 和 pCMV-Myc- 翻譯起始因子 B 共轉(zhuǎn)染 HEK293T 細胞，作為實驗組；同時將 pcDNA3.1(+) 和 pCMV-Myc- 翻譯起始因子 B 轉(zhuǎn)染 HEK293T 細胞作為對照組，轉(zhuǎn)染 24 h 后收獲細胞。將裂解后的細胞總蛋白中加入anti-c-Myc 溫育后， protein A 捕獲免疫復(fù)合物。SDS-PAGE 電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)印到確酸纖維素膜上進行We