實驗七+人體外周血淋巴細胞培養(yǎng)

1、實驗五 人的外周血淋巴細胞培養(yǎng)一、實驗原理外周血液中的小淋巴細胞，幾乎都處在G1期(或Go期)，一般情況下是不再分裂的，在培養(yǎng)液中加入植物凝血素 (PAH) 時，這種小淋巴細胞受刺激轉(zhuǎn)化成為淋巴母細胞，隨后進入有絲分裂。這樣經(jīng)過短期培養(yǎng)，秋水仙素的處理，低滲和固定，就可獲得大量的有絲分裂細胞。本方法已為臨床醫(yī)學(xué)、病毒學(xué)，藥理學(xué)、遺傳毒理學(xué)等方面廣泛應(yīng)用。二、實驗?zāi)康恼莆杖梭w微量血液體外培養(yǎng)、制備染色體標本的方法。三、實驗材料人的外周血。四、實驗器具和藥品1用具: 2毫升滅菌注射器，離心管，吸管，試管架，量筒，培養(yǎng)瓶，試劑瓶，酒精燈，燒杯，載玻片，切片盒，天平，離心機，恒溫培養(yǎng)箱，顯微鏡。2器皿

2、的清洗和消毒 玻璃器皿在使用前，均應(yīng)用肥皂水洗刷，清水沖凈，烘干后浸泡在洗液中至少2h，再用流水沖洗，烘干待消毒。將已洗凈、烘干的玻璃器皿裝入鋁盒或用紙包裝，放入干燥消毒箱內(nèi)；1501h。隔離衣、口罩。橡皮塞，注射用針筒等則用高溫高壓消毒(15磅15min)。3藥品(1) RPMI“1640”培養(yǎng)基：稱取“1640”粉末10.5克，用1000ml的雙蒸水溶解，如溶液出現(xiàn)混濁或難以溶解時，可用干冰或CO2氣體處理，如pH值降至6.0時，則可溶解而透明。每1000ml溶液加NaHCO，1.01.2g，以干冰或CO2氣體校正pH至7.07.2。立即以5號或6號細菌漏斗過濾滅菌，分裝待用。(2) 肝素

3、：作為抗凝劑使用。稱取該粉末160mg(每mg含126U)，用40ml的生理鹽水溶解，此溶液的濃度為每ml 500U。高壓消毒8磅15min。(3) 秋水仙素：作為有絲分裂的阻止劑，它能改變細胞質(zhì)的粘度；抑制細胞分裂時紡錘體形成，使細胞分裂停留在中期。稱取秋水仙素4mg，用100ml生理鹽水溶解，用6號細菌漏斗過濾，然后放入冰箱4保存。使用時用1ml注射器吸取該溶液0。050.1ml加入5ml的培養(yǎng)物中，其最終濃度為0.40.8ugml。(4) 植物凝血素(PHA)：是淋巴細胞有絲分裂刺激劑。提取PHA的方法有兩種。一種比較簡單，直接用四季豆的浸出液；另一種較復(fù)雜，最后制品為粉末。如用之得當，

4、二種方法均可獲得良好的效果。鹽水浸取法：最好用皮色四季豆，但其它顏色如紅斑色、黑色.黃色，白色的四季豆亦可。取豆子20g，用水洗凈可能粘附在種子外面的化學(xué)藥物。先在水中浸過夜(4)，次日倒去水分，將豆子放入組織攪碎器內(nèi)，加30ml生理鹽水，開動攪碎器使之成為粘糊狀，向攪碎器再加70ml生理鹽水，混合均勻。置冰箱24h。然后以3000轉(zhuǎn)min離心15min，取上清液，用生理鹽水稀釋10倍，5號除菌濾斗過濾，分裝小瓶，冰凍保存。酒精乙醚提取法：四季豆50g，先用生理鹽水洗凈。將豆浸入60ml鹽水中，保存于4冰箱內(nèi)，24h后用組織攪碎器將其磨成勻漿，再加140ml鹽水，置4冰箱中24h，取出后以60

5、00轉(zhuǎn)min離心20min，吸取上清液，調(diào)pH至5.6(用0.1molL HCl調(diào))之后，每100ml上清液加40ml無水酒精，加以攪拌，以3000轉(zhuǎn)min離心15min，取上清液，棄去沉淀。在每100ml上清液中加170ml10乙醚無水酒精(10ml乙醚十90ml無水酒精)以3000轉(zhuǎn)min離心15min，取沉淀放入培養(yǎng)皿中，在含有硅膠的抽氣干燥器中抽氣24d，沉淀物逐漸變得干硬。將沉淀物研磨成粉末，以0.85NaCl液配成1的溶液，此PHA溶液經(jīng)細菌濾器過濾后分裝在小瓶中，冰凍保存。使用時每5ml培養(yǎng)物加0.1ml即可。如果在得到沉淀物后的干燥及研磨等過程中充分保持滅菌操作，那么配成的PH

6、A溶液便無需用細菌濾器過濾。(5)抗菌素青霉素(以每瓶40萬U為例): 以4ML生理鹽水(或培養(yǎng)基)稀釋，則每ML含10萬U。取1ml加入100ml培養(yǎng)基中，則最終濃度為100Uml。鏈霉素(以每瓶50萬U為例)：以2ml生理鹽水(或培養(yǎng)基)稀釋，則每ml含25萬U。取0.4ml(含10U)加入1000ml培養(yǎng)基中，則每ml含100U(即100g)。(100萬U=lg，lg=1×106g)。(6)姬姆薩染液：0.5g姬姆薩粉末，加33ml純甘油，在研缽中研細，放在56恒溫水浴鍋中保溫90min，再加入33ml甲醇，充分攪拌，用濾紙過濾，收集在棕色細口瓶中保存，作為原液。用時以磷酸緩沖

7、液(pH7.4)1：10稀釋。(7)0.1molL磷酸緩沖液： pH7.47.6A. Na2HPO4·12H20 28.8gKH2PO4(無水) 2.67g溶解于1000ml雙蒸水中。B. Na2HPO4·7H20 2.164gNaH2PO4·2H20 0.3g溶解于1000ml雙蒸水中。五、實驗步驟1培養(yǎng)液的分裝：在無菌室或接種罩內(nèi)，用移液管將培養(yǎng)液和其它各試劑分裝入培養(yǎng)瓶，每瓶量為：培養(yǎng)液(RPMIl640或M199) 4ml小牛血清 lmlPHA 0.2ml肝素 0.05ml雙抗(青霉素加鏈霉素)培養(yǎng)液中最終濃度各為: 100Uml用3.5NaHCO3調(diào)pH

8、到7.27.4，分裝到20ml的玻瓶中，用橡皮塞塞緊，待用或置于0條件下保藏。用前從冰箱內(nèi)取出，放入37恒溫鍋中溫育10min。2采血：用2ml滅菌注射器吸取肝素(500Uml)0.05ml濕潤管壁。用碘酒和酒精消毒皮膚，自肘靜脈采血約0.3ml，在酒精燈火焰旁，自橡皮塞向培養(yǎng)瓶內(nèi)(內(nèi)含有生長培養(yǎng)基5ml)接種，輕輕搖動幾次，直立置37±0.5恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。 3培養(yǎng)：置37溫箱內(nèi)培養(yǎng)6672h。4秋水仙素處理：培養(yǎng)終止前在培養(yǎng)物中加入濃度為40gml的秋水仙素0.050.lml，最終濃度為0.40.8gml，置溫箱中處理24h。5低滲處理：低滲液的種類較多，如0.075molL的KC

9、l溶液，0.95的枸櫞酸鈉溶液，用蒸餾水稀釋4倍的Hanks液，也可直接用蒸餾水。秋水仙素處理完畢，小心地從溫箱取出培養(yǎng)瓶，用滴管吸棄上清液，培養(yǎng)物沉積在瓶底，然后加入溫育的低滲液5毫升，用滴管輕輕沖打成細胞懸液，裝入離心管中置37溫箱內(nèi)處理20min，使紅細胞破碎，白細胞膨脹。6離心: 以每1000rpm/min，離心5min，棄去上清液，收集白細胞。7固定：固定液為甲醇：冰醋酸：3：1。每只離心管中，加入固定液24ml，片刻后用滴管輕輕沖打成細胞懸液，在室溫中固定15min后，離心，吸棄上清液，留下白細胞。8再固定：加入固定液2ml，用吸管輕輕打散，室溫下繼續(xù)固定15min(過夜也可以)。

10、9再離心：除去上清液，留下白細胞制片。10制片: 向上述離心管中滴入固定液0.5毫升，用滴管小心沖打成懸液，從冰箱的冰格中或冰水中取出載玻片，每片滴加懸液13滴，用嘴輕輕吹散，用電吹風(fēng)吹干，或在酒精燈火焰上微微烤干。11染色：用磷酸緩沖液(pH7.4)稀釋后的姬姆薩染色液染色20min，然后倒去染液，用蒸餾水輕輕沖洗。12鏡檢：待稍午后，在顯維鏡下檢查。先用低倍鏡尋找良好的分裂相，然后用高倍油鏡觀察。13. 封片：用加拿大樹膠封片。選擇染色體清晰，分散度好 的細胞進行顯微攝影，進行核型分析(見圖201)。圖20-1 人體外周血培養(yǎng)與染色體標本制作示意圖六、實驗注意事項1接種的血樣愈新鮮愈好，最好是在采血后24h內(nèi)進行培養(yǎng)，如果不能立刻培養(yǎng)，應(yīng)置于4存放，避免保存時間過久，會影響細胞的活力。2在培養(yǎng)中成敗的關(guān)鍵，除了至為重要的PHA的效價外，培養(yǎng)的溫度和培養(yǎng)液的酸堿度也十分重要。人的外周血淋巴細胞培養(yǎng)最適溫度為37+0.5。培養(yǎng)液的最適pH7.27.4。3培養(yǎng)過程中，如發(fā)現(xiàn)血樣凝集，可將培養(yǎng)瓶輕輕振蕩廠使凝塊散開，繼續(xù)放回37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。4制片過程中，如發(fā)現(xiàn)細胞膨脹得不大，細胞膜沒有破裂，染色體聚集一團伸展不開；可將固定時間延長數(shù)小時或過夜。七、實驗結(jié)果1 核型分析：人類每個體細胞有46條染色體，22對常染色體和