生物化學(xué)課件第五章蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)構(gòu)

1、生物化學(xué)課件第五章蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)構(gòu) 1952年丹麥人年丹麥人Linderstrom-Lang最早提出蛋白質(zhì)最早提出蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可以分成四個(gè)層次的結(jié)構(gòu)可以分成四個(gè)層次: 一級(jí)結(jié)構(gòu)：一級(jí)結(jié)構(gòu)： 二二級(jí)結(jié)構(gòu)：級(jí)結(jié)構(gòu)： 三三級(jí)結(jié)構(gòu)：級(jí)結(jié)構(gòu)： 四四級(jí)結(jié)構(gòu)：級(jí)結(jié)構(gòu)： 1969年正式將一級(jí)結(jié)構(gòu)定義為氨基酸序列和雙硫鍵的位置。年正式將一級(jí)結(jié)構(gòu)定義為氨基酸序列和雙硫鍵的位置。 介于二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之間還存在超二級(jí)結(jié)構(gòu)（二級(jí)結(jié)介于二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之間還存在超二級(jí)結(jié)構(gòu)（二級(jí)結(jié)構(gòu)的組合）和結(jié)構(gòu)域（在空間上相對(duì)獨(dú)立）這兩個(gè)層次。構(gòu)的組合）和結(jié)構(gòu)域（在空間上相對(duì)獨(dú)立）這兩個(gè)層次。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次蛋白質(zhì)結(jié)

2、構(gòu)層次肽基的肽基的C、O和和N原子間的共振相互作用原子間的共振相互作用共振產(chǎn)生的重要結(jié)果：共振產(chǎn)生的重要結(jié)果： 限制繞肽鍵的自由旋轉(zhuǎn)限制繞肽鍵的自由旋轉(zhuǎn) 形成酰胺平面形成酰胺平面 產(chǎn)生鍵的平均化產(chǎn)生鍵的平均化 肽鍵呈反式構(gòu)型肽鍵呈反式構(gòu)型sp2sp2sp2sp3共振雜化體共振雜化體 最小的蛋白質(zhì)，由最小的蛋白質(zhì)，由A鏈鏈(21 AA)和和B (30 AA)組成；動(dòng)物胰腺組成；動(dòng)物胰腺細(xì)胞分泌的一種激細(xì)胞分泌的一種激素素,告訴細(xì)胞往里面運(yùn)輸糖、氨基酸、告訴細(xì)胞往里面運(yùn)輸糖、氨基酸、K+； 1921年年Banting & Best 從胰腺中抽提從胰腺中抽提出了有活性的胰島素，出了有活性的胰島素，1

3、923年年Banting & Macleod獲獲Nobel醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)；醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)； 194353年，年，Sanger確定了牛胰島素確定了牛胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)，的一級(jí)結(jié)構(gòu)，1958年獲得年獲得Nobel化學(xué)獎(jiǎng)；化學(xué)獎(jiǎng)； 1981年，年，Berg（因因DNA重組技術(shù)得獎(jiǎng)）重組技術(shù)得獎(jiǎng)）在大腸桿菌中表達(dá)了人胰島素在大腸桿菌中表達(dá)了人胰島素.蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的步驟蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的步驟1、蛋白質(zhì)的分離純化、蛋白質(zhì)的分離純化、測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目3、亞基分離亞基分離4、二硫鍵的拆分與保護(hù)二硫鍵的拆分與保護(hù)5、分析每一多肽鏈的氨基酸組成分析每一多肽鏈的氨基酸組成6、鑒定多肽鏈

4、的鑒定多肽鏈的N-末端和末端和C-末端殘基末端殘基7 、多種方法的部分水解多種方法的部分水解8、測(cè)序測(cè)序 9、重疊重疊10 、二硫鍵位置的確定二硫鍵位置的確定一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定策略蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定步驟氨基酸與氨基酸與2,42,4一二硝基氟苯一二硝基氟苯( (DNFB)DNFB)的反應(yīng)的反應(yīng)（sangersanger反應(yīng)）反應(yīng)）DNFB（dinitrofiuorobenzene）DNP-AA(黃色黃色)+ HF弱堿中弱堿中氨基酸氨基酸SangerSanger試劑試劑( (FDNB)FDNB)標(biāo)記標(biāo)記N N末端末端Sanger試劑標(biāo)記反應(yīng)ABCDE*ABCDE*A，*AB，*ABC，*ABCD，*AB

5、CDE*A,*A+B, *A+B+C+D+E*A,*A+*B, *A+*B+*C+*D+*E 結(jié)論：結(jié)論：A B C D ESanger試劑標(biāo)記測(cè)序H2NCHCOOH + RNCH3CH3O=S=OCl5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）pH9.7 40NCH3CH3O=S=OHNCHCOOH RDNS-氨基酸取代DNFB測(cè)定蛋白質(zhì)N端氨基酸，靈敏度高?；磻?yīng)氨基酸與苯異硫氰酯（氨基酸與苯異硫氰酯（PITCPITC）的反應(yīng)的反應(yīng)（EdmanEdman反應(yīng)）反應(yīng)）PITC（phenylisothiocyanate）+苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物(PTH-AA) （phenylisothi

6、ohydantion-AA）弱鹼中弱鹼中(400 C)(硝基甲烷硝基甲烷 400 C)H+Edman 降解法降解法(I)DABITC DABITC ：有色有色EdmanEdman試劑試劑在在EdmanEdman試劑上加發(fā)色基團(tuán)試劑上加發(fā)色基團(tuán)Edman降解法1Edman 降解法降解法(II)Edman降解法2 瑞典人瑞典人, 1946-47年在美國(guó)留學(xué)時(shí)想到改進(jìn)年在美國(guó)留學(xué)時(shí)想到改進(jìn)1930 年年Abderhalden & Brockmann發(fā)明的發(fā)明的 PITC試劑的反應(yīng)試劑的反應(yīng), 50年發(fā)明年發(fā)明Edman degradation反應(yīng)反應(yīng). 1957年移居墨爾本年移居墨爾本, 遠(yuǎn)離國(guó)際學(xué)

7、術(shù)中心開(kāi)始遠(yuǎn)離國(guó)際學(xué)術(shù)中心開(kāi)始 過(guò)隱居生活過(guò)隱居生活,1967年研制的自動(dòng)化儀器可以達(dá)到每小時(shí)一個(gè)年研制的自動(dòng)化儀器可以達(dá)到每小時(shí)一個(gè)氨基酸的速度氨基酸的速度; 他堅(jiān)持不申請(qǐng)專利他堅(jiān)持不申請(qǐng)專利, 給了美國(guó)公司得以隨便開(kāi)給了美國(guó)公司得以隨便開(kāi)發(fā)儀器的方便發(fā)儀器的方便. 1972年到德國(guó)年到德國(guó),77年因腦瘤過(guò)世年因腦瘤過(guò)世. 由于由于Edman降解產(chǎn)物需要在紫外域進(jìn)行檢測(cè)降解產(chǎn)物需要在紫外域進(jìn)行檢測(cè), 只有只有HPLC和和相應(yīng)的紫外檢測(cè)手段進(jìn)步后才得到普及相應(yīng)的紫外檢測(cè)手段進(jìn)步后才得到普及;60年代后期年代后期Moore & Stein利用該反應(yīng)測(cè)定了利用該反應(yīng)測(cè)定了RNase的一級(jí)結(jié)構(gòu)的一級(jí)

8、結(jié)構(gòu), 遺憾的是遺憾的是Edman沒(méi)有和他們分享沒(méi)有和他們分享Nobel化學(xué)獎(jiǎng)化學(xué)獎(jiǎng). + + + 肼肼法測(cè)定法測(cè)定肼法C端測(cè)定 利用外切蛋白水解酶利用外切蛋白水解酶 () 將肽鏈的氨基酸從將肽鏈的氨基酸從N端端 ()或或C端端 () 一個(gè)接一個(gè)游一個(gè)接一個(gè)游離出來(lái)，離出來(lái)， 在不同時(shí)間取樣進(jìn)行分析，根在不同時(shí)間取樣進(jìn)行分析，根據(jù)所游離的氨基酸的摩爾數(shù)的多少來(lái)判據(jù)所游離的氨基酸的摩爾數(shù)的多少來(lái)判斷氨基酸的排列順序斷氨基酸的排列順序。酶解法末端測(cè)序酶解法末端測(cè)序酶解法末端測(cè)序肽鍵的專一性水解肽鍵的專一性水解( (化學(xué)法化學(xué)法) )化學(xué)法化學(xué)法: BrCN, H+, NH2OH, etc化學(xué)法專一

9、性水解消化道內(nèi)幾種蛋白酶的專一性消化道內(nèi)幾種蛋白酶的專一性（Phe.Tyr.Trp）（Arg.Lys）（脂肪族）（脂肪族）胰凝乳胰凝乳蛋白酶蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶彈性蛋白酶彈性蛋白酶羧肽酶羧肽酶胰蛋白酶胰蛋白酶氨肽酶氨肽酶羧肽酶羧肽酶（Phe. Trp）胰蛋白酶（胰蛋白酶（trypsin）；）；胰糜乳蛋白酶（胰糜乳蛋白酶（chymotrypsin）；）；嗜熱菌蛋白酶（嗜熱菌蛋白酶（thermolysin）；）；木瓜蛋白酶（木瓜蛋白酶（papain）；）；胃蛋白酶（胃蛋白酶（pepsin）；）；枯草桿菌堿性蛋白酶（枯草桿菌堿性蛋白酶（subtilisin）肽鍵的專一性水解肽鍵的專一性水解( (酶

10、法酶法) )酶法專一性水解氨基酸的鑒定、分離純化氨基酸的鑒定、分離純化PTH-AA氨基酸的確定太短在多肽鏈中次序的決定 資料：N-末端殘基H,C-末端殘基S; 第一套肽段 第二套肽段 OUS SEO PS WTOU EOVE VERL RLA APS HOWT HO 借助重疊肽確定肽段次序： 末端殘基 H S 末端肽段HOWT APS 或 OUS 第一套肽段：HOWT OUS EOVE RLA PS 第二套肽段：HO WTOU SEO VERL APS 推斷全序列: HOWTOUSEOVERLAPS二硫鍵的斷裂：二硫鍵的斷裂：幾條多肽鏈通過(guò)二硫鍵交聯(lián)在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/

11、L鹽酸胍存在下，用過(guò)量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化。可以通過(guò)加入鹽酸胍方法解離多肽鏈之間的非共價(jià)力；應(yīng)用過(guò)甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。胰島素胰島素 -巰基乙醇巰基乙醇碘乙酸碘乙酸二二硫硫鍵鍵的的斷斷裂裂確定原多肽鏈重二硫鍵的位置：確定原多肽鏈重二硫鍵的位置： 一般采用胃蛋白酶處理沒(méi)有斷開(kāi)二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個(gè)肽段，用過(guò)甲酸處理后，將每個(gè)肽段進(jìn)行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置。二硫鍵的切割與保護(hù)二硫鍵的切割與保護(hù)二硫鍵的保護(hù)1、為防止、為防止跟跟發(fā)生交換反發(fā)生交換

12、反應(yīng)，先將自由應(yīng)，先將自由SH基封閉基封閉;2、進(jìn)行專一性部分水解、進(jìn)行專一性部分水解;3、紙層析分離水解產(chǎn)物、紙層析分離水解產(chǎn)物;4、氣相過(guò)甲酸法切斷、氣相過(guò)甲酸法切斷鍵，作第二鍵，作第二相紙層析相紙層析;5、將遷移率發(fā)生變化的多肽進(jìn)行測(cè)序、將遷移率發(fā)生變化的多肽進(jìn)行測(cè)序經(jīng)典的二硫鍵位置的確定法經(jīng)典的二硫鍵位置的確定法二硫鍵位置確定對(duì)角線電泳示意圖對(duì)角線電泳示意圖末端測(cè)序的用途常利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)常利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)蛋白質(zhì)氨基酸順序與生物功能蛋白質(zhì)氨基酸順序與生物功能研究蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系主要是：研究多肽鏈中不同部位的殘基與生物功能的關(guān)系。 進(jìn)行這方面的研究常用的方法有：同源蛋白質(zhì)氨基酸

13、順序相似性分析、氨基酸殘基的化學(xué)修飾及切割實(shí)驗(yàn)等。 例例1 鐮刀形貧血病鐮刀形貧血病l患者血紅細(xì)胞合成了一種不正常的血紅蛋白（Hb-S）l它與正常的血紅蛋白（Hb-A）的差別：僅僅在于鏈的N-末端第6位殘基發(fā)生了變化l（Hb-A）第6位殘基是極性谷氨酸殘基，（Hb-S）中換成了非極性的纈氨酸殘基l使血紅蛋白細(xì)胞收縮成鐮刀形，輸氧能力下降，易發(fā)生溶血l這說(shuō)明了蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的高度統(tǒng)一性蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的個(gè)體差異蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的個(gè)體差異例例2 一級(jí)結(jié)構(gòu)的局部斷裂與蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的局部斷裂與蛋白質(zhì)的激活激活 體內(nèi)的某些蛋白質(zhì)分子初合成時(shí)，常帶有抑制肽，呈無(wú)活性狀態(tài)，稱為蛋白質(zhì)原.蛋白質(zhì)原的

14、部分肽鏈以特定的方式斷裂后，才變?yōu)榛钚苑肿?例：胰島素，在剛合成時(shí)，是一個(gè)比成熟的胰島素分子大一倍多的單鏈多肽，稱為前胰島素原前胰島素原的N-末端有一段肽鏈，稱為信號(hào)肽.信號(hào)肽被切去，剩下的是胰島素原。胰島素原比胰島素分子多一段C肽，只有當(dāng)C肽被切除后才成為有51個(gè)殘基，分A、B兩條鏈的胰島素分子單體.例例3 同源蛋白同源蛋白 同源蛋白：是指在不同有機(jī)體中實(shí)現(xiàn)同一功能的蛋白質(zhì).同源蛋白中的一級(jí)結(jié)構(gòu)中有許多位置的氨基酸對(duì)所有種屬來(lái)說(shuō)都是相同的，稱為不變殘基；其他位置的氨基酸稱可變殘基.不同種屬的可變殘基有很大變化.可用于判斷生物體間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近.例：細(xì)胞色素Cl60 個(gè)物種中，有 27 個(gè)位置

15、上的氨基酸殘基完全不變，是維持其構(gòu)象中發(fā)揮特有功能所必要的部位，屬于不變殘基.l可變殘基可能隨著進(jìn)化而變異，而且不同種屬的細(xì)胞色素 C氨基酸差異數(shù)與種屬之間的親緣關(guān)系相關(guān)。親緣關(guān)系相近者，氨基酸差異少，反之則多（進(jìn)化樹(shù)）.黃色： 不變殘基（invariable residues）藍(lán)色 ： 保守氨基酸（conservative residues）未標(biāo)記：可變殘基（variable residues）不不同同生生物物來(lái)來(lái)源源的的細(xì)細(xì)胞胞色色素素c c中中不不變變的的AAAA殘殘基基14106100134323029271817675952514845413887848280706891GlyGlyPheCysGlyGlyGlyArgLysGlyCysLysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTrpTyr707580LysLysLysProProTyrIleGlyThrMetAsnLeu血紅素血紅素細(xì)胞色素細(xì)胞色素c c分子的空間結(jié)構(gòu)分子的空間結(jié)構(gòu)不變不變的的AAAA殘基殘基 38個(gè)不變的個(gè)不變的AA殘基，是殘基，是Cyt C 的生物功能所不的生物功能所不可缺少的。其中有的可能參加維持分子構(gòu)象；有的可缺少的。其中有的可能參加維持分子構(gòu)象；有的可能參與電子傳