昆蟲對農(nóng)藥抗性的研究進展

1、昆蟲對農(nóng)藥抗性的研究進展摘 要：隨著化學農(nóng)藥在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)過程中的廣泛應用，害蟲對農(nóng)藥的抗性不斷增強。因此，昆蟲對農(nóng)藥的抗性機制已成為當前重要的研究課題之一?，F(xiàn)代分子生物學技術的運用使有關抗性機制的研究呈現(xiàn)多層次、多方位的研究特點。綜述了近年來有關昆蟲抗藥性幾種機制的研究進展，如代謝抗性機制、靶標抗性機制等，以期為昆蟲的抗性研究提供參考。關鍵詞：昆蟲；農(nóng)藥；抗性機制長期使用殺蟲劑易使昆蟲產(chǎn)生不同程度的抗藥性，甚至產(chǎn)生交互抗性，從而不利于生態(tài)環(huán)境的保護和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本的降低。因此，昆蟲的抗性機制研究逐漸成為重要的研究課題之一，在過去的半個多世紀中，人們不斷從各個方面對昆蟲的抗性機制進行研究，以了解其

2、產(chǎn)生抗性的機理，從而為抗性監(jiān)測和新農(nóng)藥研制提供依據(jù)。昆蟲抗性研究從最初的行為、生理到代謝再到作用靶標，實現(xiàn)了跨越式發(fā)展。近年來，昆蟲抗性機制的研究主要集中于抗性基因的表達和調(diào)控。大多數(shù)研究認為，昆蟲的抗藥性機制主要包括藥劑穿透率下降、昆蟲體內(nèi)解毒酶活力增強即代謝抗性與靶標敏感性降低等。其中解毒酶主要包括細胞色素P450介導的多功能氧化酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）、水解酯酶等；3個主要作用靶標分別為乙酰膽堿酯酶（AChE）、神經(jīng)軸突鈉離子通道（SC）和-氨基丁酸（GABA）受體-氯離子通道復合體。而隨著昆蟲基因組全序列的測序完成以及基因組研究技術的開發(fā)運用，大大地促進了抗性基因的鑒別，使昆蟲的抗

3、性機制研究在代謝機制和作用靶標這兩方面取得了重大突破。1 代謝抗性機制的研究1.1 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的研究目前，從分子水平上探索谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）的作用機制已經(jīng)十分普遍，PCR等分子生物學技術的應用使人們對昆蟲抗性機理的研究邁上了一個新的臺階。潘敏慧等1通過在 sf9 細胞中真核表達家蠶（Bombyx mori）GSTe3，確定了家蠶GSTe3 的表達具有較高的組織特異性，它只在家蠶血液和頭部表達，其真核表達產(chǎn)物具有較好的GSTs 酶活性；劉海濤等2研究表明，BmGSTe5 可能是參與合成 GSTs 的主要基因。以GST基因為目標的研究還有很多，這些研究都在一定程度上加深了

4、人們對GSTs抗性機理的了解。1.2 羧酸酯酶基因的研究劉海濤等2推測家蠶對藥劑產(chǎn)生抗性可能是因為其體內(nèi)的羧酸酯酶（CarE）發(fā)生了突變，提高了對殺蟲劑的水解能力。黃水金等3利用RT-PCR技術和RACE方法獲得了1個斜紋夜蛾（Spodoptera litura）CarE基因的全長cDNA序列，命名為Slest2，并推測Slest2的過量表達可能是斜紋夜蛾對溴氰菊酯產(chǎn)生抗性的分子機制之一，這種推測為進一步研究夜蛾科昆蟲的抗性機理奠定了基礎。蘭亦全等4研究也表明羧酸酯酶活性的提高是甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）對氰戊菊酯和順式氯氰菊酯產(chǎn)生抗性的重要原因。2 靶標抗性機制的相關研究

5、2.1 乙酸膽堿酯酶基因的研究乙酸膽堿酯酶（AChE）作為抗性機制中的一個重要靶標，成為從基因表達和基因調(diào)控角度研究抗性機制的重點。陳亮等5對斜紋夜蛾乙酰膽堿酯酶基因cDNA片段進行克隆和序列分析，為獲取斜紋夜蛾乙酰膽堿酯酶基因全序列以及研究其變構乙酰膽堿酯酶的分子機制奠定了基礎。大量試驗表明，不敏感AChE對于殺蟲劑的抗性歸因于很多潛在的與抗性相關的點突變。以AchE基因（ace）為例，昆蟲的ace發(fā)生突變，其產(chǎn)物AChE發(fā)生變構，使其對有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的敏感性降低，從而使昆蟲產(chǎn)生抗藥性6。李兵7研究表明，家蠶Bm-ace2和野桑蠶（Bombyx mandarina）Bmm-ace

6、2 的突變是導致其對有機磷農(nóng)藥抗性差異的原因之一。此外，劉海濤等2也發(fā)現(xiàn)家蠶雌雄個體之間Bm-ace2基因的表達量不同，導致AChE 的活性存在明顯差異，并最終使雌雄個體表現(xiàn)出不同的抗性。研究家蠶AChE活性及其ace基因的表達模式，為探索家蠶對有機磷農(nóng)藥抗性的分子機制提供了依據(jù)，并且通過與野桑蠶比較，為家蠶對有機磷農(nóng)藥的抗性退化研究提供新的依據(jù)。2.2 鈉離子通道蛋白基因的研究趙華強等8以野桑蠶為材料，利用RT-PCR技術克隆了野桑蠶鈉離子通道蛋白基因的cDNA片段，發(fā)現(xiàn)該基因cDNA片段編碼氨基酸序列包括鈉離子通道蛋白亞基的跨膜結構域、和，并存在a、b、c 3個選擇性微外元。但尚不清楚在發(fā)

7、育調(diào)控中，這3個微外元對鈉離子通道蛋白產(chǎn)生的影響。2.3 煙堿型乙酰膽堿受體的研究煙堿型乙酰膽堿受體（nAChRs）作為昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的神經(jīng)遞質(zhì)受體，也是幾類重要殺蟲劑的作用靶標，近年來在其抗性機理上取得了明顯進展。趙宇等9利用RT-PCR和RACE技術，克隆了小菜蛾（Pplutella xylostella）nAChR 亞基的一個新基因Px8，為研究小菜蛾nAChR的亞基類型、亞基組合形式、藥理學特征及其在小菜蛾對多殺菌素的靶標抗性機制方面的作用提供了重要依據(jù)。此外，在褐飛虱（Nilaparvata lugens）抗性機理的研究中，nAChRs的附屬蛋白作用的發(fā)現(xiàn)10，也為抗性研究提供

8、了更多的選擇。3 其他基因的研究3.1 家蠶SerB基因除了對ace基因的廣泛研究，與抗性有關的其他基因也在不斷被尋找中。葛君等11發(fā)現(xiàn)，家蠶在對有機磷農(nóng)藥代謝解毒過程中磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶（SerB）的表達量增加，其基因mRNA轉(zhuǎn)錄與其蛋白的表達呈現(xiàn)相同趨勢，推測該基因可能與家蠶對有機磷農(nóng)藥的抗性存在一定關系。3.2 P450基因與AChE相似，P450基因表達量的升高一定程度上增強了昆蟲的抗藥性。黃水金等12推斷細胞色素P450 基因CYP4M14和CYP4S9的過量表達可能與斜紋夜蛾對溴氰菊酯的高水平抗性有關。張林林等13在對田間灰飛虱（Laodelphgax striatellus）抗藥性

9、進行研究時發(fā)現(xiàn)，細胞色素P450的CYP6家族中的10條基因序列以及CYP4家族中的6條基因序列在抗性品系中的表達量明顯高于敏感品系。值得注意的是，雖然針對任何一種殺蟲劑的高水平抗性，可能只涉及其中少數(shù)幾個對該化合物有針對性的基因，但仍需關注這些基因的表達對其他基因的影響。4 病原微生物在抗性機理上的研究目前，除了從基因組學角度研究各類酶外，一系列病原微生物與昆蟲體內(nèi)酶的關系的研究也在進行。王龍江等14推測球孢白僵菌（Beauveria bassiana）感染紅火蟻（Solenopsis invicta）后，影響了其體內(nèi)各種酶的活性，導致其體內(nèi)某一種或幾種保護酶的合成受到抑制，從而破壞了這幾種

10、酶在昆蟲體內(nèi)的作用或它們之間的協(xié)同作用，最終引起寄主一系列的生理病變。其中CarE的活力呈先下降后上升的趨勢，而AchE的活力則呈先上升后下降的趨勢，說明球孢白僵菌能抑制其體內(nèi)AchE的活性，這對于以后紅火蟻的生物防治具有重要意義，但具體機制還有待進一步研究。另外，研究結果還表明球孢白僵菌侵染紅火蟻工蟻后會刺激CarE和AchE活性，產(chǎn)生一種免疫防御反應，這與昆蟲對化學農(nóng)藥的抗性機理顯著不同14。5 病原微生物與基因組學大腸桿菌（Escherichia coli）是第一個用于重組蛋白生產(chǎn)的宿主菌15，是目前應用最廣泛的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)。任文彬等16通過克隆高毒力金龜子綠僵菌（Metarrhizi

11、um anisopliae）中一個幾丁質(zhì)酶基因，構建pGEX-chi融合表達載體，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，經(jīng)SDS-PAGE結果分析顯示，表達出的融合蛋白大小為68 kD，占蛋白表達總量的64.5%。該試驗從分子生物學和微生物學角度出發(fā)，為今后昆蟲的抗性機理研究提供了一個很好的例子，為新農(nóng)藥的研究提供了一條新的思路。該試驗還成功地在大腸桿菌中高效融合表達了金龜子綠僵菌幾丁質(zhì)酶，為以后對綠僵菌幾丁質(zhì)酶性質(zhì)與作用的研究奠定了基礎。幾丁質(zhì)酶作為入侵宿主的一個重要毒力因子，是生物防治的一個重要選擇。郝蕾蕾等17研究結果表明，幾丁質(zhì)酶在球孢白僵菌中分泌達到一定閾值后會顯著提高病菌的毒力，但具體機制還

12、有待研究?？赡苁瞧渲苯蛹觿×藢ハx表皮幾丁質(zhì)的分解，或是通過協(xié)助蛋白酶的分泌來強化這種分解。若能確定其作用機理，那么將為昆蟲抗性機理研究提供另一個重要依據(jù)。6 結語與展望人類與昆蟲之間的拉鋸戰(zhàn)已經(jīng)持續(xù)了數(shù)千年，一直到科學技術高度發(fā)展的今天仍然進行著。隨著人類對昆蟲認識水平的深入，防治技術也在不斷提高。自20世紀40年代DDT問世以來，人類在這場拉鋸戰(zhàn)中取得了重大進展，但隨之又帶來了一系列問題，其中較為緊迫的一項便是昆蟲對農(nóng)藥的抗性。尋找新的抗性研究途徑一直是人們關注的重點，但在尋找新途徑的同時也要對已有途徑進行創(chuàng)新利用。對于當前熱門的基因工程來說，與微生物研究結合有可能是一條可行性非常高的途徑

13、，將引領我們不斷探索未知的領域。有害生物綜合防治（IPM）技術研究過程中，應該以生態(tài)學、多戰(zhàn)術、協(xié)調(diào)共存和經(jīng)濟學這四大觀點為主導，立足于生產(chǎn)實踐，多角度、多手段地對昆蟲抗藥性機理進行探索。參考文獻1 潘敏慧，許湲，余泉友，等家蠶谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶GSTe3基因的鑒定及其真核表達J.中國農(nóng)業(yè)科學，2010，43（4）：873-880.2 劉海濤，李兵，趙國棟，等家蠶幼蟲不同齡期體內(nèi)主要解毒酶及其基因表達的性別差異J.昆蟲學報，2010，53（5）： 479-486.3 黃水金，秦文婧，陳瓊斜紋夜蛾羧酸酯酶基因的克隆、序列分析及表達水平J.昆蟲學報，2010，53（1）：29-37.4 蘭亦全，

14、趙士熙甜菜夜蛾對氰戊菊酯和順式氯氰菊酯的抗性機理J.應用生態(tài)學報，2010，21（1）：203-208.5 陳亮，李兵，浦冠勤斜紋夜蛾乙酰膽堿酯酶基因cDNA片段的克隆和序列分析J.蠶業(yè)科學，2010，36（1）：138-142.6 唐振華，畢強殺蟲劑作用的分子行為M.上海：上海遠東出版社，2003：641-644.7 李兵家蠶和野桑蠶對有機磷農(nóng)藥抗性的研究D.蘇州：蘇州大學，2009：14-20.8 趙華強，宋麗莉，李兵，等野桑蠶鈉離子通道蛋白基因 Bmmpara 的克隆與選擇性剪接J.蠶業(yè)科學，2010，36（3）：435-441.9 趙宇，楊亦樺，武淑文，等小菜蛾煙堿型乙酰膽堿受體亞基c

15、DNA的克隆、序列分析與不同發(fā)育階段表達分析J.昆蟲學報，2009，52（1）：17-26.10 Yang B, Yao X, Gu S, et al. Selectivity of lynx proteins on insect nicotinic acetylcholine receptors in the brown planthopper, Nilaparvata lugensJ. Insect Mol Biol, 2010, 19(3): 283-289.11 葛君，王舉梅，李兵，等殺蟲劑辛硫磷誘導家蠶脂肪體蛋白的表達特征及SerB基因的組織轉(zhuǎn)錄活性分析J.蠶業(yè)科學，2010，36（

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18、 Guanqin( Department of Horticulture, Soochow University, Suzhou Jiangsu 215123 )Abstract: As the widely use of chemical pesticides in agriculture and forestry production, the pesticide resistance of insects was the trend of getting stronger. So, researches about resistance mechanism of pesticide have been one of the important issues now. And the use of molecular biology technology made the researches develop variously. T