MTT原理步驟結(jié)果分析方法及注意事項(xiàng)

1、MTT原理、步驟、結(jié)果分析方法及注意事項(xiàng)MTT分析法以活細(xì)胞代謝物還原劑3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑藍(lán)為基礎(chǔ)。MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下tetrazolium環(huán)開裂，生成藍(lán)色的formazan結(jié)晶，formazan結(jié)晶的生成量?jī)H與活細(xì)胞數(shù)目成正比（死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原）。還原生成的formazan結(jié)晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸鈉（pH 4.7）的M

2、TT溶解液中溶解，利用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的光密度OD值，以反映出活細(xì)胞數(shù)目。也可以用DMSO來溶解。MTT粉末和溶液保存時(shí)都需要避光，用鋁箔紙包好就可以。實(shí)驗(yàn)的時(shí)候我一般關(guān)閉超凈臺(tái)上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。 MTT步驟如下：1：接種細(xì)胞：用含10胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔100010000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200ul.2:培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)35天（可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間）。3：呈色：培養(yǎng)35天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS <ph=7.4>配)20ul.繼續(xù)孵育4小時(shí)，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)

3、培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。4：比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。注意事項(xiàng)：（1）選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。（2）避免血清干擾：一般選小于10的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。（3）設(shè)空白對(duì)照：與試驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照。其他試驗(yàn)步驟保持一致，最后比色以空白調(diào)零。MTT實(shí)驗(yàn)吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個(gè)范圍就不是直線關(guān)系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50的時(shí)候藥物的濃度。把藥

4、品稀釋成不同的濃度，然后計(jì)算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖，然后得到50抑制率時(shí)候的藥品濃度，就是IC50。要點(diǎn)：藥品2倍稀釋，多做梯度，做點(diǎn)線圖即可！舉個(gè)例子：各組濃度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀釋倍數(shù)為10，最大濃度為0.1，抑制率為0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入 計(jì)算公式：Pm=0.95Pn=0.06P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.0

5、6)/4)=-3.6025IC50=0.00025 有一個(gè)公式可供參考;lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最大劑量I:lg(最大劑量/相臨劑量)P:陽性反應(yīng)率之和Pm:最大陽性反應(yīng)率Pn:最小陽性反應(yīng)率抑制率=1-加藥組OD值/對(duì)照組OD值公式中的最大最小陽性反應(yīng)率就是最大最小抑制率 例：用96孔板培養(yǎng)SMMC-7721肝癌做MTT測(cè)細(xì)胞活力,應(yīng)該加多少1640培養(yǎng)基,多少M(fèi)TT和DMSO合適?根據(jù)書上說的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要盡量去掉培養(yǎng)液，便于DMSO溶解甲臜顆粒進(jìn)行比色測(cè)定一般每孔4000個(gè)細(xì)胞為宜，既細(xì)胞

6、濃度在20000個(gè)/ml，MTT加20ul，作用四小時(shí)后洗掉上清液，注意不要將甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脫色搖床上振蕩10分鐘，然后測(cè)吸光值。-一般要低于IC50，避免非調(diào)亡性殺傷的細(xì)胞太多，造成流式細(xì)胞儀檢測(cè)碎片太多。我一般用1/2-1/3的IC50，作用時(shí)間為36h。一般腫瘤細(xì)胞系空白處理的調(diào)亡率應(yīng)低于1%，用藥后一般為5-10%（Annexin V），細(xì)胞周期的亞G0峰比較明顯.MTT原理MTT全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，是一種黃顏色的染料?；罴?xì)胞線粒體中琥珀酸脫

7、氫酶能夠代謝還原MTT，同時(shí)在細(xì)胞色素C的作用下，生成藍(lán)色（或藍(lán)紫色）不溶于水的甲臜（Formazan），甲臜的多少可以用酶標(biāo)儀在570nm 處進(jìn)行測(cè)定。在通常情況下，甲臜生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比，因此可根據(jù)光密度OD值推測(cè)出活細(xì)胞的數(shù)目。由于死細(xì)胞中不含琥珀酸脫氫酶，因此加入MTT 不會(huì)有反應(yīng)。MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22m濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4 避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。需要注意的是，MTT法只能用來檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)和

8、相對(duì)活力，但不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果的時(shí)候，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范圍內(nèi)。產(chǎn)品簡(jiǎn)介：     MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(MTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit)被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的檢測(cè)。MTT可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成結(jié)晶狀的深紫色產(chǎn)物formazan。在特定溶劑存在的情況下，可以被完全溶解。然后通過酶標(biāo)儀可以測(cè)定570nm波長附近的吸光度。細(xì)胞增殖越多越快，則吸光度越高；細(xì)胞毒性越大，則吸光度越低。 

9、60;  本試劑盒采用了獨(dú)特的Formazan溶解液配方，無需去除原有的培養(yǎng)液，可以直接加入Formazan溶解液溶解formazan。從而避免了由于去除培養(yǎng)液時(shí)formazan被部分去除而引起的誤差。    本試劑盒本底低，靈敏度高，線性范圍寬，使用方便。    關(guān)于不同細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒的比較和選擇請(qǐng)參考：        本試劑盒可以測(cè)定500個(gè)樣品。包裝清單：產(chǎn)品編號(hào) 產(chǎn)品名稱 包裝 C0009-1M

10、TT溶液 5mlC0009-2Formazan溶解液 55ml 說明書 1份 保存條件：    MTT溶液-20避光保存，一年有效；Formazan溶解液室溫或-20保存。注意事項(xiàng)：    由于使用96孔板進(jìn)行檢測(cè)，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長，一定要注意蒸發(fā)的問題。一方面，由于96孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加PBS，水或培養(yǎng)液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)。    MTT溶液為黃色，需避光保存，長時(shí)間光照會(huì)導(dǎo)致失效。當(dāng)顏

11、色變?yōu)榛揖G色時(shí)，請(qǐng)勿使用。    Formazan溶解液結(jié)凍或產(chǎn)生沉淀時(shí)可以37水浴孵育以促進(jìn)溶解，并且必須在全部溶解并混勻后使用。    為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。1.AO吖啶橙/EB雙熒光染色法是一種鑒別細(xì)胞壞死和凋亡的簡(jiǎn)便方法。AO能夠進(jìn)入正常細(xì)胞膜的細(xì)胞中，與DNA結(jié)合顯綠色/黃綠色熒光。早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜正常，胞漿濃縮，核DNA濃縮致密，低倍鏡下呈熒光亢進(jìn)的圓珠狀小體，高倍鏡下可見不規(guī)則的塊狀熒光。晚期凋亡細(xì)胞胞膜通透性破壞被EB染成紅色，核形態(tài)與早期凋亡細(xì)胞相似，或?yàn)闈馊镜募t色碎片(核碎裂)或凋亡小體。而細(xì)胞壞死時(shí)，細(xì)胞膜的完整性早期即被破壞，線粒體明顯腫脹，細(xì)胞體積明顯增大，呈不均勻的橙紅色熒光.AO/EB雙染色法：待細(xì)胞長至80匯合，加入順鉑(5、10、20g/ml)作用24、48、72h后，再加入0.25胰蛋白酶及0.02EDTA消化細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度為107/ml，