基因操作實(shí)驗(yàn)講義

1、碩士爭(zhēng)辯生基因操作試驗(yàn)技術(shù)試驗(yàn)講義試驗(yàn)簡(jiǎn)介：本試驗(yàn)的目的是將嗜熱脂肪芽孢桿菌AS 1411的淀粉酶結(jié)構(gòu)基因（全長(zhǎng)1.4kb）接受PCR方法擴(kuò)增后接入大腸桿菌表達(dá)載體pLac18，構(gòu)建成重組載體pLac18-amy，重組載體再轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，重組大腸桿菌可以在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)出耐熱-淀粉酶活性。通過(guò)本試驗(yàn)的訓(xùn)練使同學(xué)在DNA重組，基因高表達(dá)方面得到全面的訓(xùn)練并加深對(duì)lac操縱子的理解。試驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取、酶切、電泳鑒定1.1 試驗(yàn)材料LB培育基 ：NaCl 10 g/L, Trypton 10g/L, Yeast Extract 5 g/LLB培育基II ：NaCl 10 g/

2、L, Trypton 10g/L, Yeast Extract 5 g/L，Glucose 5 g/L質(zhì)粒小量快速提取試劑盒（由北京博大泰克公司贊助）含質(zhì)粒pLac18的大腸桿菌JM109臺(tái)式高速離心機(jī)水浴鍋1.2 用硅膠膜分別法小量提取質(zhì)粒這一方法的基本原理是在含強(qiáng)陰離子洗滌劑的堿性溶液中細(xì)胞裂開(kāi)而染色體和蛋白質(zhì)變性，并和裂開(kāi)的細(xì)胞壁相互纏繞成大型復(fù)合物，分子量較小的質(zhì)粒DNA和RNA釋放到上清液中，前者被被十二烷基硫酸鹽包蓋。當(dāng)用鉀離子取代鈉離子時(shí)，這些復(fù)合物會(huì)從溶液中有效的沉淀下來(lái)。用SDS和強(qiáng)堿處理細(xì)胞是使質(zhì)粒和染色體分別的關(guān)鍵步驟，這時(shí)染色體和其他成分形成的復(fù)合物是比較脆弱的，如動(dòng)作

3、過(guò)于猛烈或處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)有較多的染色體釋放到清夜中在隨后用溶液III處理時(shí)這部分染色體照舊和質(zhì)?；煸谝黄?，由于質(zhì)粒和染色體均屬于DNA因此兩者很難再被分開(kāi)。硅膠具有一特殊的性質(zhì)，即在高離子強(qiáng)度的溶液中可以與核酸專一性的結(jié)合，而在離子強(qiáng)度降低后又能與所結(jié)合的核酸分別。質(zhì)粒提取試劑盒就是依據(jù)這一原理實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒的快速純化。全部試劑均由試劑盒配套 接種重組大腸桿菌一環(huán)于含氨芐青霉素的LB培育基中培育過(guò)夜。 取1.5 ml離心管，倒入約1.5 ml菌液。8,000 r/m離心30 s。棄盡上清。 加入100 mL溶液1，徹底懸浮菌體。 加入150 mL溶液2，顛倒離心管數(shù)次，使細(xì)菌完全裂解，溶液透亮。

4、加入150 ml溶液3，顛倒離心管6-8次，可見(jiàn)白色絮狀物產(chǎn)生，室溫放置10 min，8,000 r/m離心3 min。 在離心吸附柱中加入結(jié)合緩沖液（質(zhì)粒提取專用）400 ml，再將上清液加入離心吸附柱中，混勻，8,000 r/m離心30 s。 倒棄收集管內(nèi)液體，在吸附柱內(nèi)加入500 ml漂洗液，8,000 r/m離心30 s，洗去雜質(zhì)。倒棄收集管內(nèi)液體，8,000 r/m離心30 s，除去殘留液體。 將質(zhì)粒純化柱放在一潔凈的1.5 mL離心管中，加入75 ml 洗脫緩沖液（elution buffer）至管內(nèi)柱面上，放置10 min。 8,000 r/m離心30 s，所得液體就是馬上可用的

5、超純質(zhì)粒。 1.3 質(zhì)粒的酶切與電泳鑒定 質(zhì)粒的酶切試驗(yàn)材料質(zhì)粒pLac18，上述試驗(yàn)提取限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hind III：寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品，由上海浩嘉生物技術(shù)公司贊助，包括酶20 U/mL，酶反應(yīng)緩沖液等試驗(yàn)步驟1 取已滅菌的500 mL離心管一支，用記號(hào)筆標(biāo)上組號(hào)，依次加入雙蒸水12 mL，質(zhì)粒5 mL，緩沖液M 2 mL，限制性內(nèi)切酶1 mL，混勻。2 將上述溶液于37 水浴30 min。酶切產(chǎn)物的電泳試驗(yàn)材料和儀器50TAE緩沖液：Tris 242 g，冰醋酸 57.1 mL，0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 100 mL，定容至1 LTAE緩沖液

6、：取50TAE緩沖液10mL，加入純水至500 mL溴化乙錠溶液：10 mg，加水至1 mL，充分溶解瓊脂糖：華美公司分裝Amresco產(chǎn)品電泳槽：迷你-31B型，北京六一儀器廠（含電泳槽，制膠槽）電泳儀：DYY-6B 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀凝膠成像儀：美國(guó)alpha22001 取50 mL小燒杯一個(gè)，加入瓊脂糖0.14 g，加入TAE緩沖液20 mL，在電爐上煮沸。2 放置到約50 時(shí)，加入溴化乙錠溶液1 mL，混勻，倒入制膠槽中，插上制膠梳子。3 待凝膠凝固后，將凝膠放入電泳槽內(nèi)，拔取制膠梳子。4 取待檢測(cè)DNA 4 mL，加入0.5 mL加樣緩沖液，混勻。5 將加入了加樣緩沖液的待測(cè)樣品加入加樣

7、孔中。6 打開(kāi)電泳儀，調(diào)整電壓至50 V，保持穩(wěn)壓。7 電泳約50min，關(guān)閉電泳儀，當(dāng)心取出凝膠，將凝膠放入凝膠成像儀中，觀看電泳結(jié)果。試驗(yàn)二 嗜熱脂肪芽孢桿菌淀粉酶基因的PCR擴(kuò)增以及PCR產(chǎn)物的純化2.1 試驗(yàn)材料： Taq DNA聚合酶（含Taq酶Buffer，dNTP）（注：本試驗(yàn)中PCR反應(yīng)試劑用上海賽百盛公司TaqPremix代替，該產(chǎn)品已經(jīng)預(yù)先加入了水，Taq DNA聚合酶，酶反應(yīng)緩沖液和dNTP，做PCR反應(yīng)時(shí)只要加入特異性的模板DNA和引物即可），內(nèi)切酶BamH I均為大連TaKaRa公司產(chǎn)品，由上海浩嘉生物技術(shù)公司贊助。小量PCR產(chǎn)物純化試劑盒為上海生工生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

8、2.2 試驗(yàn)步驟A 淀粉酶基因的PCR擴(kuò)增與鑒定1取200 L PCR管一支按挨次加入： TaqPremix 反應(yīng)液 47L 引物: 2 L 嗜熱脂肪芽孢桿菌染色體DNA 1 L 94變性10 min,加入Taq DNA聚合酶5個(gè)單位。2混合后進(jìn)行PCR反應(yīng)(94 60 s，58 60 s，72 120 s)，經(jīng)過(guò)20個(gè)循環(huán)后在72延長(zhǎng)10 min。電泳鑒定PCR結(jié)果B 用硅膠柱純化PCR產(chǎn)物1. 取PCR產(chǎn)物（50 mL），轉(zhuǎn)移到一潔凈的1.5 mL離心管中，加入5倍體積的Binding Buffer（PB），混勻。2. 將硅膠柱放入收集管中，把混合液轉(zhuǎn)移到柱內(nèi)，室溫放置2分鐘；8,000

9、r/m離心30 s。3. 倒掉收集管中的廢液，將硅膠柱放入同一根收集管中，加入500 mL 漂洗液（Wash Solution），8,000 r/m離心30 s。4. 重復(fù)步驟4。5. 倒掉收集管中的廢液，將硅膠柱放入同一根收集管中，8,000 r/m離心30 s。6. 將硅膠柱放入一潔凈的1.5 mL離心管中，在硅膠柱的膜中心加入50 mL TE Buffer，室溫10 min。7. 8,000 r/m離心30 s，離心管中的液體即為回收的DNA片段。C. PCR產(chǎn)物的酶切鑒定1. 取已滅菌的500 mL離心管一支，用記號(hào)筆標(biāo)上組號(hào)，依次加入雙蒸水12 mL，質(zhì)粒5 mL，緩沖液K 2 mL

10、，限制性內(nèi)切酶BamH I 1 mL，混勻。2. 將上述溶液于37 水浴60 min，50V電泳60 min電泳鑒定酶切結(jié)果。試驗(yàn)三 感受態(tài)大腸桿菌JM109制備3.1 試驗(yàn)材料 0.1mol/L CaCl2，純水配制，過(guò)慮滅菌3.2 試驗(yàn)步驟1挑取E.coli JM109單菌落于2ml液體LB培育基中，37振蕩培育過(guò)夜。2取0.2ml培育液于20mlLB培育基中， 猛烈振蕩培育約1小時(shí)。3取1.5ml離心管，加入培育液1.5ml，冰浴15分鐘，4，8,000R/M離心1分鐘，棄盡上清液。用預(yù)冷的0.1mol/L氯化鈣溶液懸浮菌體，于冰水中放置15分鐘。48,000 R/M離心1分鐘，棄盡上清

11、液，用預(yù)冷的100l 0.1mol/L氯化鈣懸浮菌體。5冰水中或4放置12-24小時(shí)，用于轉(zhuǎn)化。試驗(yàn)四 PCR產(chǎn)物和載體的酶切，純化和連接4.1 試驗(yàn)材料：核酸內(nèi)切酶EcoR I、Hind III，試劑盒高效連接液（mighty），均為TaKaRa公司產(chǎn)品，由上海浩嘉生物技術(shù)公司贊助。小量DNA膠回收試劑盒為上海華舜公司產(chǎn)品。連接試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品。4.2 試驗(yàn)步驟APCR產(chǎn)物酶切取0.5mL離心管一支按挨次加入超純水7L經(jīng)PCR純化柱純化的PCR產(chǎn)物：10L緩沖液M：2.0L核酸內(nèi)切酶EcoR I、Hind III（混合物）1mL混勻，8,000 r/m離心30 s 37酶切3 h

12、 載體酶切取0.5mL離心管一支按挨次加入超純水14L載體：3LBuffer M：2L核酸內(nèi)切酶EcoR I、Hind III（混合物）：1 L混勻，8,000 r/m離心30 s 37酶切3 hC用硅膠柱純化酶切載體及PCR產(chǎn)物同試驗(yàn)2DPCR產(chǎn)物與載體的連接取經(jīng)酶切純化的PCR產(chǎn)物4L，載體1 mL混合加入連接試劑盒高效連接液 5L，混合。16反應(yīng)過(guò)夜試驗(yàn)五連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化子鑒定5.1 試驗(yàn)材料：感受態(tài)大腸桿菌5.2 試驗(yàn)步驟1取感受態(tài)細(xì)胞1支（大腸桿菌JM109），加入連接產(chǎn)物1L。2于冰水中放置20-30分鐘， 42水浴精確計(jì)時(shí)90秒，冰浴5分鐘。3各管加入LB培育基II 0.5m

13、l，37水浴45-60分鐘，涂布氨芐青霉素平板（固體LB培育基II中加入氨芐青霉素至100g/ml），37培育16小時(shí)。試驗(yàn)六 連接轉(zhuǎn)化子的鑒定6.1 試驗(yàn)材料6.2 轉(zhuǎn)化子的鑒定1挑取連接物轉(zhuǎn)化子2個(gè)，在固體LB培育基II上劃線分別，37培育過(guò)夜，各區(qū)一個(gè)菌落，分別接入10mL 液體 LB培育基II（氨芐青霉素100mg/mL）中，37振蕩培育過(guò)夜。2取菌液于1.5 ml離心管，8,000 r/m，1分鐘離心收集菌體。3. 提取質(zhì)粒（同試驗(yàn)1）4取10 mL 質(zhì)粒加入2mL buffer M，1mL EcoR I、Hind III酶混合液，混勻37反應(yīng)30 min。12酶切產(chǎn)物電泳，凡能產(chǎn)生

14、一條兩個(gè)片段，分別為2.4kb和1.4kb為所需重組質(zhì)粒（pLac18-amy），劃線分別并保藏轉(zhuǎn)化子。試驗(yàn)七 重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化子酶活鑒定71 試驗(yàn)材料：2 淀粉溶液碘液：2g KI ，1g I2，加水致100mL100 mg/mL IPTG為Pharmacia公司產(chǎn)品72 試驗(yàn)步驟1挑取E.coli JM109（pLac18-amy）單菌落于10 ml液體LB培育基II（氨芐青霉素100mg/mL）中，37振蕩培育過(guò)夜。2. 取100 mL菌液于10 ml液體LB培育基II（氨芐青霉素100mg/mL）中，培育至對(duì)數(shù)后期，離心收集細(xì)胞。分別以2 mL下列液體培育基懸浮細(xì)胞：A：液體LB培育基B：液體LB培育基II振蕩培育4h。2 培育液用超聲波裂開(kāi)（