正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化二氧化碳超臨界流體萃取茯苓多糖工藝參數(shù)

1、正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化二氧化碳超臨界流體萃取茯苓多糖工藝參數(shù)趙子劍，連琰，王國(guó)全，李萬(wàn)偉【摘要】目的優(yōu)選二氧化碳超臨界流體（C02-SFE）萃取茯苓多糖工藝參數(shù)。方式以茯苓多糖為評(píng)判指標(biāo)，采納正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)C02-SFE萃取茯苓多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。結(jié)果最正確提取工藝條件為：溫度35,壓強(qiáng)20MPa,夾帶劑（水）用量ml/g,萃取ho結(jié)論優(yōu)選出的工藝科學(xué)合理?！娟P(guān)鍵詞】茯苓；正交實(shí)驗(yàn)法；二氧化碳超臨界流體萃取Abstract：ObjectiveTooptimizetheC02-SFEprocessofpachymaninPoriacocos(Schw.)wolf.MethodsTheorthogonal

2、testwasusedtooptimizeC02-SFEprocessofpachymaninporiacocos(Schw.)wolfwiththerateofpachymaninporiacocos(Schw.)wolfasindex.ResultsTheoptimalextractionprocedurewasasfollows:theextractiontemperaturewas35,theextractionpressurewas20MPa,thecontentofchemicalpreparationwasml/gandtheextractiontimewas40h.Conclu

3、sionTheoptimumextractionprocedureisreasonableandstable.Keywords：Poriacocos(Schw.)Wolf.；Orthogonaltest；Supercriticalfluidextraction茯苓，別名茯菟、松腴、不死面、松薯1,為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf.的干燥菌核，其味甘、淡，性平,能健脾利濕，益智安神，其要緊有效成份茯苓多糖2是一種非特異性免疫增進(jìn)劑，其不僅能夠提高機(jī)體的抗病能力，還有較強(qiáng)的抗癌作用3o茯苓有效成份提取工藝，傳統(tǒng)方式有水煎、醇提取或乙醛提取等，這些方式成效差，有效成份損失

4、嚴(yán)峻，雜質(zhì)較多，質(zhì)量不穩(wěn)固，難以保證藥物的療效。超臨界流體萃取(SupercriticalFluidExtraction,SFE)是一種最近幾年快速進(jìn)展起來(lái)的新型提取分離技術(shù)，具有無(wú)毒性、選擇性強(qiáng)、不易燃、溶劑可循環(huán)利用等優(yōu)勢(shì)。它專門適合于不穩(wěn)固天然產(chǎn)物和生理活性物質(zhì)的分離與精制:41為了提高茯苓多糖的質(zhì)量，咱們以茯苓多糖為考察指標(biāo)，進(jìn)行用C02超臨界流體萃取茯苓多糖的實(shí)驗(yàn)，對(duì)茯苓超臨界C02流體萃取工藝進(jìn)行考察，以確信萃取操作工藝條件，為實(shí)現(xiàn)SFE大規(guī)模萃取茯苓多糖提供工藝參數(shù)?，F(xiàn)報(bào)導(dǎo)如下。1材料茯苓（湖南靖州），HA121-50-05超臨界萃取裝置（江蘇南通華安超臨界萃?。?，二氧化碳，UV

5、2550（日本島津），電子天平，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（供含量測(cè)定用，批號(hào)，中國(guó)藥品生物制品查驗(yàn)所），苯酚，濃硫酸和鋁片等。2方式藥材粉碎度的選擇超臨界萃取中，物料的粒度對(duì)提取效率有較大的阻礙，通常不同質(zhì)地的物料需選擇不同的粒度，才能保證較佳的提取效率。參照文獻(xiàn)條件，取不同粒度茯苓藥材;在萃取壓力25MPa,萃取溫度45,解析壓力4MPa等相同條件下萃取2h,考察粒度對(duì)茯苓多糖得率的阻礙。結(jié)果見(jiàn)表1。表1藥材粒度對(duì)茯苓多糖得率的阻礙（略）實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，藥材粒度為2060目時(shí)，提取時(shí)提取率較好。茯苓提取物中多糖含量的測(cè)定方式4%苯酚溶液的配制取苯酚100g,加鋁片g和碳酸氫鈉g,蒸儲(chǔ)并搜集182儲(chǔ)分，稱取

6、4g,在100ml容量瓶加水溶解至刻度線，然后放冰箱內(nèi)冷臧備用（必需在182c時(shí)搜集其儲(chǔ)分）。在蒸鐳進(jìn)程中，還要操縱好冷凝程度，假設(shè)冷凝管內(nèi)的水流量過(guò)快，那么會(huì)專門快使得其中的儲(chǔ)分結(jié)晶而阻礙到儲(chǔ)分的正常搜集。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線周密稱取置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12h以上的無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)15mg,置25nli容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻置室溫下（約240C）備用（濃度為mg/ml）o周密量取對(duì)照品溶液，ml,別離置于100ml容量瓶中,并加水至刻度，搖勻。周密量取上述各溶液2ml,置具塞試管中，別離加入4%的苯酚溶液1ml,混勻后迅速加入濃硫酸ml,搖勻，并于45水浴中保溫30min后掏出，

7、置冰水浴中5min后掏出。然后以第1份為空白對(duì)照組，用分光光度法在490nm的波優(yōu)勢(shì)測(cè)定其吸收度A,以吸光度A為縱坐標(biāo)，溶液濃度C為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。得回歸方程：Y=4+3X,相關(guān)系數(shù)r=5,葡萄糖濃度在mg/ml范圍內(nèi)吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系。見(jiàn)圖1。苯酚-硫酸法測(cè)茯苓多糖含量將各提取方式所得樣品制成1g/ml的溶液，周密量取2nd,照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方式，用紫外分光光度法測(cè)定其吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程中計(jì)算出待測(cè)溶液濃度，并進(jìn)一步計(jì)算出其多糖含量（以葡萄糖量計(jì)）。結(jié)果見(jiàn)表3o正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)依照C02-SFE工藝的阻礙因素，選取溫度、壓強(qiáng)、夾帶劑用量、萃取時(shí)刻為考察因素5,6,

8、進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，并以茯苓多糖（以葡萄糖計(jì)）為評(píng)判指標(biāo)，優(yōu)選C02-SFE萃取茯苓多糖最正確工藝。因素水平見(jiàn)表2,結(jié)果見(jiàn)表3,方差分析見(jiàn)表4。表2因素水平設(shè)計(jì)（略）表3正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）表4方差分析（略）結(jié)果分析由表3能夠知，極差中D項(xiàng)最大，第二為C項(xiàng)，A項(xiàng)最小，即該4個(gè)因素對(duì)多糖產(chǎn)量的阻礙程度由大到小為：D>C>B>Ao說(shuō)明在該實(shí)驗(yàn)條件下，各因素對(duì)茯苓多糖產(chǎn)率阻礙的主次順序是：萃取時(shí)刻>夾帶劑（水）用量>萃取壓強(qiáng)>萃取溫度。由表4可知，因素C、D對(duì)多糖產(chǎn)量有顯著性阻礙，其他兩個(gè)因素沒(méi)有顯著性阻礙。就多

9、糖產(chǎn)率而言所選適宜的提取工藝為：A1B2C2D3；綜合考慮，確信工藝為：A1B3C3D3,即C02-SFE萃取茯苓多糖的最正確工藝條件為：溫度35,壓強(qiáng)20mPa,夾帶劑（水）用量ml/g,萃取ho、最正確提取工藝驗(yàn)證在上述最正確條件下溫度35,壓強(qiáng)20mPa,夾帶劑（水）用量ml/g,萃取h1進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表5。表5最正確條件驗(yàn)證明驗(yàn)（略）從表5可看出，最正確提取工藝條件具有較好重復(fù)性，茯苓多糖得率較高，說(shuō)明該最正確工藝條件是合理、靠得住的。3討論阻礙超臨界C02萃取的因素有：萃取壓力、萃取溫度、萃取物顆粒大小、C02流量、夾帶劑等。在本儀器中，C02流量與萃取壓力相關(guān),因此未將其

10、列入考察因素。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，萃取壓力水平?jīng)]有顯著性阻礙，這可能是萃取壓力選擇過(guò)小或萃取壓力本身對(duì)多糖的萃取沒(méi)有阻礙的緣故。至于是哪一緣故，將在下一步的實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)研究。萃取溫度在。C是臨界值，高于此溫度才是超臨界狀態(tài)，45是超臨界萃取經(jīng)常使用的較高溫度，因此選擇35,40,453個(gè)水平。在本次C02超臨界流體萃取茯苓多糖的實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中采納的是等溫變壓工藝，即超臨界C02的萃取和分離在同一溫度下進(jìn)行。該工藝由于沒(méi)有溫度的轉(zhuǎn)變，從而操作簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)對(duì)高沸點(diǎn)、熱敏性、易氧化物質(zhì)的接近常溫的萃取，專門適合于從天然產(chǎn)物中提取有效成份。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，僅因素C、D對(duì)萃取茯苓多糖產(chǎn)率的阻礙具有顯著性；茯苓多糖

11、的平均得率為，超過(guò)了文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的水提醇沉提取方式所取得的茯苓多糖得率，可是不及用堿液浸提的茯苓多糖的產(chǎn)率7,這可能是因?yàn)閴A液水解了部份沒(méi)有藥理作用的多糖和其他物質(zhì)的緣故。至于用堿液浸提的茯苓多糖和用二氧化碳超臨界流體萃取的茯苓多糖及用水提醇沉方式取得的茯苓多糖的藥理作用及相對(duì)分子量有什么不同，將在下一步的實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)研究。本研究通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確信了茯苓多糖最正確萃取條件，并考察了各因素對(duì)萃取結(jié)果的阻礙大小，為爾后科學(xué)地選擇超臨界C02萃取多糖條件提供了有利的參考?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1宋子成.中藥風(fēng)險(xiǎn)速查M.沈陽(yáng)：遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，2005：106.2胡斌，楊益平，葉陽(yáng).茯苓化學(xué)成份研究J.中草藥,2006,37(5):655.3張璐,劉強(qiáng).茯苓多糖制備工藝及藥理作用研究進(jìn)展J.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2006,12(4):61.4沈國(guó)良.超臨界