豬流感疫苗研究進展 (1).docx

1、豬流感疫苗研究進展陳永忠劉業(yè)兵二夏業(yè)才之(1.育海省西寧市畜牧獸醫(yī)站，西寧810003；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)收稿日期12009-05-07文獻標(biāo)識碼1A【文章編號|1002-1280(2009)060038-05中圖分類號|S859.797摘要全面綜述了國內(nèi)外豬流感(SI)疫苗的研究現(xiàn)狀。從激發(fā)體液免疫、細(xì)胞免疫、交叉保護以及避免母源抗體干擾和區(qū)分野毒感染等方面分別闡述了常規(guī)疫苗、減毒疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗、病毒活載體疫苗的研究進展，以期找到最佳控制豬流感的疫苗及免疫方案，為進一步研究豬流感疫苗提供參考。關(guān)鍵詞豬流感；病毒；疫苗ResearchProgressofS

2、wineInfluenzaVaccineCHENYong-zhong1,LIUYe-bing2,XIAYe-cai2(1.AnimalHusbandryandVeterinaryStationofXiningCityinQinghaiProvince,Xining810003;2.ChinaIrutUuieofVeterinaryDrugControltBeijing100081；China)Abstract:Thisarticlereviewedthecurrentresearchsituationofswineinfluenza(SI)vaccine.Itdetailedresearchd

3、evelopmentofswineinfluenzavaccinesinrespectofexcitationhumoralimmunity,cellimmunity,crossprotection,avoidingmaternalantibodyinterferenceanddifferentiatingfieldinfectionincludingconventionalvaccine,attenuatedvaccine,subunitvaccine,DNAvaccine,livevaccinebasedonvirusvector.Thisarticleprovidedreferences

4、fortheresearchofswineinfluenzavaccinesothathumancouldobtainthebestvaccineand作者簡介：陳永忠(1970年-)，高級獸醫(yī)師，大學(xué)本科，主要從事臨床獸醫(yī)方面的工作。E-mail：cyzl9700101vaccinationschemetocontrolswineinfluenza.Keywords：swineinfluenza；virus；vaccine豬流行性感冒(Swineinfluenza,SI),簡稱豬流感，是由豬流感病毒(Swineinfluenzavirus,SIV)引起的一種豬的急性、熱性和高度接觸性呼吸道傳

5、染病。它不僅引起病豬高熱、食欲減退、咳嗽、呼吸困難及出欄時間延遲等，而旦極易引起其他病毒和細(xì)菌的混合感染，使疫情變得更加嚴(yán)重。更重要的是，豬呼吸道上皮細(xì)胞表面同時存在人流感病毒受體SA2a22以及6Gal和禽流感病毒(AvianinHuen-zavirus,AlV)受體5入2022及36戒，這樣豬既可感染人流感病毒，又可感染AIV,從而成為人和禽流感病毒重組的理想“混合器”。Ito等證實，AIV連續(xù)在豬體內(nèi)傳代，可產(chǎn)生人流感病毒樣特性。因此,SI不僅給畜禽養(yǎng)殖造成了重大經(jīng)濟損失，而且對人類健康造成嚴(yán)重威脅,而有效的疫苗將會降低豬群中流感的發(fā)病率和豬作為人流感病毒儲存庫的可能性。近年來，豬流感疫

6、苗的研究已成為熱點，并取得了很大的進展。本文就豬流感疫苗的進展作一綜述,為進一步研究豬流感疫苗提供參考。1常規(guī)疫苗豬流感常規(guī)疫苗是滅活的全病毒疫苗,其形式多為常規(guī)油佐劑疫苗，滅活劑一般采用甲醛或BEIO豬流感疫苗中技術(shù)最成熟的主要是Hl亞型和H3亞型單價或雙價豬流感全病毒滅活疫苗。滅活疫苗通過誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗血凝素(HA)、神經(jīng)或酸恤(NA)等抗體，從而產(chǎn)生對感染的保護。對豬流感全病毒滅活疫苗免疫效果有重要影響的因素之一是疫苗毒株的選擇，由于各地流行的SIV毒株在抗原性和遺傳特性方而有所不同，所以疫苗株的選擇一定要與當(dāng)?shù)亓餍卸局晗嗥ヅ洹＠?，歐洲使用的疫苗大多含有較早分離NewJersey/76

7、(H1N1)株和PortChalmers/73(H3N2)株。美國目前使用的豬流感疫苗主要含有古典H1N1亞型SIV和三重排H3N2亞型SIV變異株，為了提高疫苗的針對性，美國一些豬場還特別使用本場分離株的“自家疫苗”。而我國研制的豬流感疫苗一般使用經(jīng)過實驗室培育的現(xiàn)地分離毒株。據(jù)報道，用H1N1和H3N2亞型的豬流感疫苗分別免疫4周齡和8周齡流感病毒血清陰性豬,2次免疫后3周，用H1N2亞型流感病毒氣管內(nèi)攻毒，中和試驗表明免疫豬產(chǎn)生了針對H1N2的交叉反應(yīng)抗體，并旦僅產(chǎn)生了溫和的呼吸道癥狀，而對照豬產(chǎn)生了嚴(yán)重的呼吸道癥狀。Amy等使用滅活疫苗抵御異型病毒攻毒試驗表明，當(dāng)體內(nèi)含有HlN2豬流感

8、病毒的豬，使用經(jīng)典豬H1N1型流感病毒滅活疫苗免疫注射后，會使免疫保護失敗，不同病毒不能夠提供交又保護力，并H.會增加疾病的嚴(yán)重程度。Bikour等用H3N2SIV滅活疫苗加鋁佐劑免疫小豬,2周后加強免疫1次。2次免疫后6d，用lOCIDH3N2SIV氣管內(nèi)攻毒，結(jié)果表明，試驗疫苗誘導(dǎo)了高效價的針對H3N2SIV的血凝抑制(Hemagglutinationinhibition!)抗體,抑制了所有臨床癥狀和病毒擴散，并減輕了肺的損傷。隨著反向遺傳技術(shù)的不斷成熟,利用該技術(shù)在體外獲得豬流感病毒人丁.標(biāo)記疫苗株，進而研制出全病毒基因工程滅活疫苗的工作也已取得突破性進展，新疫苗不僅效價高，而且可以針對

9、流行毒株的變異情況及時調(diào)糧疫苗株的組成部分，節(jié)省了過去分離培育新毒株所消耗的大隋時間，具有良好的應(yīng)用前景。Ruben等報道滅活疫苗能使發(fā)病率降低30%-70%,使死亡率降低60%87%。滅活疫苗對攻毒的保護情況與免疫后機體產(chǎn)生的抗體水平緊密相關(guān)，除了疫苗株外，其他一些因素，如抗原量、佐劑、免疫時豬的健康狀況、適當(dāng)?shù)囊呙缃臃N途徑及適當(dāng)?shù)慕臃N時機等均會影響疫苗的免疫效力。目前，滅活疫苗在歐美多個國家已實現(xiàn)商品化供應(yīng)。例如，美國在1993年就已批準(zhǔn)使用H1N1亞型單價豬流感疫苗,1998年又推出使用H3N2亞型單價疫苗和豬流感(H1N1+H3N2)雙價滅活疫苗。國內(nèi)的華南農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾

10、濱獸醫(yī)研究所等單位在豬流感油乳劑滅活疫苗研制方面做了大量工作，其研究結(jié)果表明，用國內(nèi)分窗毒株培育后制備的H1亞型和H3亞型單價和雙價豬流感油乳劑滅活疫苗經(jīng)一次免疫后3周HI抗體效價即可達到1:160以上，免疫后4周HI抗體水平超過1：400,至免疫后12周HI抗體滴度仍可保持在1:100以上，超過1：80的有效抗體保護標(biāo)準(zhǔn)。如果進行二免，則HI抗體水平更高，免疫持續(xù)期可達到6個月以匕，能滿足各種日齡豬只的防疫需要。對于H1亞型單價豬流感滅活苗的保護力，王文華的研究得到進一步證實,豬群抗H1亞型豬流感病毒HI抗體效價高于1:160時能完全抵御同亞型豬流感病毒攻擊。多數(shù)免疫豬場將豬流感疫苗用于母豬

11、，尤其是產(chǎn)仔前。研究表明，母豬免疫接種對控制哺乳仔豬的流感發(fā)生非常重要，旦通常能在整個哺乳期提供保護。對于育肥豬通常很少實施免疫接種,但在易發(fā)生豬流感的老豬場，對豬群采取免疫接種措施是有益的。然而育肥豬的免疫接種可能很難與母豬的免疫接種結(jié)合起來，因為被動免疫時間的延K可能干擾仔豬的有效免疫接種。目前商品化的豬流感滅活疫苗對預(yù)防豬流感雖然發(fā)揮了重要作用，但是滅活疫苗的接種會對疫苗免疫豬與自然感染豬的鑒別診斷造成障礙,影響疫病的監(jiān)測，并旦對異源和異型病毒不能提供有效保護，因此滅活疫苗很難有效控制抗原性多變的豬流感病毒在豬群中的感染與傳播。另外，豬流感全病毒滅活疫苗還存在產(chǎn)生抗體較慢、誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的

12、能力弱、應(yīng)激反應(yīng)強等不足。Heinen等比較了疫苗免疫豬和自然感染豬的免疫效果,發(fā)現(xiàn)疫苗免疫豬在攻毒后短期內(nèi)排毒,而自然感染豬則得到完全保護，分析表明疫苗免疫豬產(chǎn)生了相同或更高的血清HI、病毒中和抗體及核蛋白(NP)特異的IgG抗體，但是鼻黏膜IgA滴度和淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)較低，這可能解釋了免疫后的亞保護狀態(tài)。特別是疫苗生產(chǎn)毒株大多來自流行毒株，一旦疫苗制備過程發(fā)生病毒泄漏，容易造成環(huán)境污染，誘發(fā)新的疫情。為此，不斷探索開發(fā)新型豬流感疫苗有著十分重要的意義。2減毒疫苗減毒疫苗一般是以生物學(xué)或其他方法降低或消除病原體的致病性，但保留了感染性和抗原性的一種活疫苗，因此能模擬動物白然感染狀態(tài)來刺激免疫

13、應(yīng)答,既可產(chǎn)生體液免疫，又可產(chǎn)生細(xì)胞免疫，為宿主提供長期的有效保護，但有毒力返祖和不同毒株間重組等風(fēng)險。研究表明,SIV各亞型內(nèi)的遺傳和抗原異質(zhì)性可能降低疫苗的效力"七為適應(yīng)豬流感病毒抗原的多變性，需要開發(fā)能誘導(dǎo)不同亞型和毒株間交叉保護免疫的豬流感疫苗。感染H1N1亞型SIV的豬能部分抵抗H3N2SIV的攻擊，攻毒后,發(fā)熱和排毒比正常對照豬明顯降低,病毒不能傳播給同群非攻毒豬，并且未能檢測到排毒。H1N1、H3N2和H1N2亞型HA基因是異源的，用H1N1或H3N2亞型疫苗鼻內(nèi)接種，雖不能保護免疫豬不發(fā)病，但是免疫豬能對H1N2SIV攻毒表現(xiàn)出部分保護，與對照豬相比,鼻內(nèi)排毒減少2d

14、,病毒復(fù)制明顯減少，而且同時感染H1N1和H3N2的免疫豬對H1N2獲得了完全保護，在肺和鼻分泌物中檢測不到H1N2SIV,即使檢測到，其含量也大大下降。然而，用商品化H1N1和H3N2雙價滅活疫苗經(jīng)肌肉接種，不能保護豬免受H1N2攻擊'°）。這些結(jié)果說明活的SIV接種可提供不同費株間的交又保護。但是目謝還未能獲得安全的SIV減毒疫苗株。Solorzano等"L通過分子生物學(xué)技術(shù)，獲得了NS1基因部分缺失的H3N2SIV,實驗表明，其毒力大大降低，有望作為豬流感減毒疫苗候選株。用NS1基因部分缺失的H3N2減毒疫苗免疫豬，然后用野生同型H3N2或異型H1NISIV進

15、行攻毒，可完全保護同型SIV攻擊，雖不能阻止異型SIV對肺部造成的眼觀病變，但是可顯著降低肺部的顯微病變和減少呼吸道病毒【。所有免疫豬血清中均產(chǎn)生了針對H3N2SIV的高水平HI抗體和ELISA抗體及黏膜IgA,而對NS1呈陰性反應(yīng)。盡管異型免疫不能對感染提供完全保護，但對阻止豬群中流感病毒進一步擴散還是非常有效的。今后這類疫苗的發(fā)展方向是利用基因工程等手段研制出能夠與野毒明顯區(qū)別、不易返強、培養(yǎng)滴度高的人工標(biāo)記弱毒株。但是目前還未能獲得既安全又能滿足臨床應(yīng)用要求的SIV減毒疫苗株。3亞單位疫苗亞單位疫苗是通過物理、化學(xué)方法或基因工程手段獲取病原體主要免疫原蛋白而制成的一種疫苗，它可以有效避免

16、利用全病原體生產(chǎn)疫苗而導(dǎo)致的生物安全風(fēng)險，并有利于提高疫苗中有效成分的濃度、純度，以及開發(fā)多價、多聯(lián)疫苗。而且因為只是病毒的特定蛋白在起作用，所以對于診斷、免疫劑量:等都可以達到人為控制的目的。滅活疫苗在預(yù)防豬流感時存在許多缺點,而研究發(fā)現(xiàn)亞單位疫苗可以在多方面起到補充作用。在常規(guī)疫苗中HA和NA同時存在于病毒粒子表面，抗原間存在競爭性抑制關(guān)系，HA對NA產(chǎn)生的T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫有一定抑制作用,但是將HA和NA純化后作為亞單位疫苗或作為常規(guī)疫苗的補充物可消除這種競爭關(guān)系。目前人用流感疫苗已經(jīng)從第1代的全病毒滅活疫苗發(fā)展到第3代的全裂解病毒亞單位疫苗。新一代疫苗除去了病毒成分中與免疫功能關(guān)系不大

17、且對機體有應(yīng)激作用的大分子蛋白及熱源質(zhì)，而將HA和NA濃縮,因此這種疫苗對機體的應(yīng)激性小，接種后抗體上升快、維持時間長，具有很好的免疫效果，也具有更高的生物安全性。目前，在許多國家的人群中已開始全面使用第3代全裂解流感病毒亞單位疫苗。但這種亞單位疫苗的生產(chǎn)成本過于昂貴，短期內(nèi)用于豬流感疫苗生產(chǎn)的可能性不大。對于豬流感亞單位疫苗,人們把更多希望放在構(gòu)建基因工程疫苗方面:利用原核表達系統(tǒng)（大腸桿菌）或真核表達系統(tǒng)（酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞等）在體外表達豬流感病毒流行毒株的HA基因和NA基因，然后收獲、濃縮和純化目的蛋白,再進一步制成疫苗。這種方法的優(yōu)點是制備過程簡弟、FI的蛋白含量大、主要成分

18、可以定量配置。但由于體外表達的蛋白難以維持或恢復(fù)天然蛋白的空間結(jié)構(gòu),蛋白純化過程復(fù)雜、成本高，而且總體免疫效果尚不及傳統(tǒng)的全病毒滅活疫苗，因此對這類疫苗的生產(chǎn)工藝還需進一步改進。4DNA疫苗目前研制的DNA疫苗在免疫途徑、方法、程序等多方面還不成熟，免疫效果不穩(wěn)定，離實際應(yīng)用還有較大距離。商品化的豬流感疫苗通常是滅活的全病毒或亞單位疫苗，可以降低發(fā)病的嚴(yán)重程度和發(fā)病率，但不能對免疫豬提供完全保護。而DNA疫苗具有減毒疫苗的許多優(yōu)點，且沒有其毒力返祖和不同毒株間重組等風(fēng)險，易于構(gòu)建和制備，穩(wěn)定性好，成本低廉,便于儲存運輸和注射，尤其是抗原被MHCI和MHCII類分子所遞呈,能激發(fā)體液和細(xì)胞免疫反

19、應(yīng)。Larsen等用表達HA的DNA疫苗免疫豬,初免后4周，再用滅活疫苗加強免疫1次，與單純接種2次DNA疫苗相比,產(chǎn)生了更高水平的特異性抗體和更強的攻毒保護效果。根據(jù)SIV的HA、NA、NP和M（基質(zhì)蛋白）等主要抗原表位基因構(gòu)建的豬流感復(fù)合多表位DNA疫苗，在Helq細(xì)胞中表達的重組蛋白具有良好的抗原性"婦，可能是較理想的豬流感候選疫苗。最近,Tompkins等用表達A型流感病毒M2共同序列的DNA疫苗免疫小鼠,誘導(dǎo)出M2特異性抗體，并旦對致死性攻毒產(chǎn)生了保護。先用M2DNA疫苗初免，再用表達M2的重組腺病毒加強免疫，提高了與人流感病毒和禽流感病毒M2交叉反應(yīng)的抗體，并且產(chǎn)生了T細(xì)

20、胞反應(yīng)。實驗結(jié)果表明，M2DNA疫苗初免并強化接種，能對致死性A型流感病毒（包括H5N1）攻擊產(chǎn)生廣譜保護作用。DNA疫苗能夠同時誘導(dǎo)機體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答,但由于DNA疫苗蛋白表達噠低，激發(fā)的免疫應(yīng)答較弱，從而限制/它的應(yīng)用,其中分子佐劑的應(yīng)用是提高DNA疫苗免疫效果的重要舉措。李國新等*證實，三拷貝分子佐劑C3d與分泌型HA融合后能夠提高DNA疫苗誘導(dǎo)的抗體水平。5活載體疫苗活載體疫苗克服了滅活疫苗和亞單位疫苗的不足，同時具有弱毒疫苗的一切優(yōu)點。母源抗體的存在對疫苗接種有負(fù)面影響,不僅延長了感染豬發(fā)熱和臨床癥狀，而且與無母源抗體的免疫豬相比，豬流感病毒對具有母源抗體的免疫豬誘導(dǎo)

21、的肺炎更加嚴(yán)重M,理想的疫苗還需要排除母源抗體的干擾，而活載體疫苗利用的是體內(nèi)表達系統(tǒng)，所表達的蛋白更加真實，而旦因為病毒自身的復(fù)制能力，所以只需極少劑鼠的接種就可產(chǎn)生足夠外源蛋白。重組活載體疫苗可同時啟動體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)，不會出現(xiàn)毒力返強，而且產(chǎn)生的保護性反應(yīng)是針對載體病毒和外源蛋白來源病毒的，所以可達到一針防多病的目的。表達人流感病毒的H1N1、H3N2亞型HA的重組痘苗病毒能夠誘導(dǎo)血凝素的產(chǎn)生，并刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。被用作載體的包括人腺病毒5型（humanadenovirus5,Had5）、豬腺病毒3型（porcineadenovirus3,PAV3）、豬偽狂犬病病毒（PRV

22、）、桿狀病毒（Baculo-vinis）等。這類載體普遍具有容易插入外源基因且對外源基因的容鉞大、自身相對穩(wěn)定、基因組重排頻率低、不與宿主基因發(fā)生整合等優(yōu)點。表達SIVHA的重組偽狂犬病病毒（rPRV2HA）接種小鼠，在免疫后3周產(chǎn)生rSIVHI抗體，免疫后28d，用105TCID的異源SIV鼻內(nèi)攻毒，從免疫鼠中未分離到攻毒株，僅在肺部觀察到了輕微的病理損傷'脫。表明表達SIVHA的重組偽狂犬病病毒能保護小鼠免受SIV異源毒株的攻擊,可以作為預(yù)防SIV和PRV的候選疫苗。Tang等"刃用含有H3N2SIVHA的重組腺病毒免疫小鼠，在免疫后2周產(chǎn)生了針對SIV的高水平HI抗體,

23、初免后3周再加強免疫，抗體水平大大提高。雖然是這些抗體不能中和異源病毒，但仍能保護免疫小鼠抗異源病毒的攻擊。Wesley等對3周齡小豬分別免疫表達HA和表達HA與NP的重組腺病毒混合物，免疫豬群在4周內(nèi)均產(chǎn)生了高水平的特異性HI抗體。免疫HA與NP重組病毒混合物的豬群獲得了完全保護，攻毒后無鼻腔散毒和肺部損傷。因此豬群同時接種這兩種復(fù)制缺陷型腺病毒疫苗對預(yù)防豬流感是有效的，與商品化疫苗相比的另一個優(yōu)點是沒有母源抗體干擾哺乳小豬的早期免疫），并旦這種復(fù)制缺陷型重組腺病毒不會傳播給哨兵豬S）。目前華南農(nóng)業(yè)大學(xué)開發(fā)的腺病毒載體豬流感已進入轉(zhuǎn)基因安全評價階段，應(yīng)用前景戊好。由于母豬和小母豬缺少對人類腺

24、病毒5的質(zhì)粒疫苗的免疫力，所以豬流感病毒的抗原可以使用這些疫苗（質(zhì)粒）進行表達。Wesley等:的研究表明，用表達豬流感病毒血球漫集素和核蛋白的人腺病毒5重組病毒進行免疫后不存在母源抗體的干擾，7日齡的仔豬被H3N2感染的母豬哺乳，注射不能表達HA和NP的Ad-5質(zhì)?；蛘咴诔醮蚊庖邥r使用具有目的基因片段復(fù)制缺陷的Ad-5病毒，該病毒原應(yīng)表達SIVH3N2亞型血球凝集素和核蛋白。sham-注射組（對照）的HI檢測的滴度顯示持續(xù)性抗體水平下降，而在注射Ad-5SIV第二周后出現(xiàn)較強的免疫應(yīng)答。在豬4周齡的時候,sham-注射組的HI滴度降到45,sham-注射組以及一半的Ad-5S1V免疫組豬體使

25、用商品化的SIV滅活疫苗進行二免。進行二免后,原來具有母源抗體干擾的豬體擁有較強的記憶應(yīng)答，但是那些sham-注射的豬體不能夠?qū)ι虡I(yè)化的疫苗產(chǎn)生免疫應(yīng)答。由于母源抗體會干擾傳統(tǒng)SIV疫苗的作用,這些重組Ad-5SIV疫苗對于免疫系統(tǒng)抵制母源抗體的作用是有效的。人們在不斷開發(fā)新的活載體基因工程疫苗的同時，也在努力解決抗原濃縮、二次免疫受初次免疫抗體干擾、部分豬只對疫苗過敏等問題,希望不久的將來這類疫苗能夠得到廣泛的應(yīng)用，可以作為傳統(tǒng)全病毒滅活疫苗的補充。綜上所述,豬流感常規(guī)滅活疫苗、減毒疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗和活載體疫苗在生產(chǎn)和使用中各具優(yōu)缺點。隨著疫苗研究工作的不斷深入，研制出安全、有效

26、的豬流感疫苗也只是時間問題，它必將為保障畜牧業(yè)健康發(fā)展、減少人類發(fā)生疫病的隱患做出應(yīng)有的頁獻。參考文獻：1GutierrezMartinCB,RodrigueDelgado0,AlvarezNislaal.SimultaneousSerdogicaEvidenceofActinobacilluspleuropneu-moniae.PRRS.Aujcszky*sDiseaseandInfluenzaVirusesinSpan,ishFini如ngpi快J.ResVetSci,2000,68(l)：9-13ItoT,CouceiroJN,Kdmal.MolecularBasisfortheGene

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