參龍煎劑對(duì)肺纖維化肺組織形態(tài)學(xué)影響的實(shí)驗(yàn)研究

1、參龍煎劑對(duì)肺纖維化肺組織形態(tài)學(xué)影響的實(shí)驗(yàn)研究         【摘要】  目的：觀察參龍煎劑對(duì)博來(lái)霉素致大鼠肺纖維化的防治作用。方法：將大鼠按照性別、體重隨機(jī)分為空白組、模型組、潑尼松組（5.4mg/kg）、參龍煎劑低劑量組（生藥量0.675g/ml）、參龍煎劑中劑量組（生藥量1.2g/ml）、參龍煎劑高劑量組（生藥量2.4g/ml）。按照BLM5mg·kg1體重復(fù)制大鼠肺纖維化模型。24小時(shí)后給藥，觀察各實(shí)驗(yàn)組7天、14天、28天肺組織病理形態(tài)表達(dá)情況的變化。結(jié)果：參龍煎劑治療后模型大鼠肺部炎

2、癥浸潤(rùn)情況減輕、肺泡破損減輕、膠原沉積減少。結(jié)論：結(jié)果表明，證實(shí)了參龍煎劑能夠改善肺纖維化的異常組織結(jié)構(gòu)，使延緩肺纖維化的病程成為了可能。 【關(guān)鍵詞】  肺纖維化 HE染色 Masson染色肺纖維化是一組病因各異、表現(xiàn)相似的疾病譜，其病理主要表現(xiàn)為早期的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺組織損傷，晚期的細(xì)胞外基質(zhì)及膠原沉積和肺組織結(jié)構(gòu)的重塑1。許多研究表明，肺纖維化初期肺組織病理學(xué)改變以肺炎癥浸潤(rùn)為主，大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺組織充血、腫脹，后期則以膠原纖維增生為主，大量膠原纖維代替正常組織，使肺組織破壞、功能喪失23。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察參龍煎劑即通過(guò)補(bǔ)肺益腎、祛瘀通絡(luò)法對(duì)肺纖維化作用機(jī)制進(jìn)行探討。通過(guò)對(duì)各

3、組大鼠的一般狀態(tài)、病理形態(tài)的比較來(lái)說(shuō)明參龍煎劑對(duì)博萊霉素引起的機(jī)體系統(tǒng)臟器損傷和一般功能狀態(tài)的損害有一定的保護(hù)作用。1  資料1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康Wistar大鼠216只：雌雄各半，體重180210g，由沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（遼）2003-0016），按清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。2  實(shí)驗(yàn)藥品 鹽酸平陽(yáng)霉素（BLM）：哈爾濱博萊制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字：H23021807，批號(hào)06060201，8mg/支。參龍煎劑：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬二院制劑室制備，主要成分由黃芪、沙參、當(dāng)歸、川芎、熟地、地龍、甘草等中藥組成。醋酸潑尼松片

4、：國(guó)藥準(zhǔn)字H12020698，產(chǎn)品批號(hào)051108。5mg/片，天津天藥藥業(yè)股份有限公司。3  主要試劑及儀器萬(wàn)能顯微鏡（日本  OLYMPUS 公司）BI-2000圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；HE染色、Masson染色試劑（中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司）。2  實(shí)驗(yàn)方法2.1  動(dòng)物模型制備 參照Szapiel方法，將大鼠麻醉，暴露氣管，一次性注入BLM注射液（5mg·kg1），左右旋轉(zhuǎn)鼠板，使BLM注射液均勻分布于兩肺，制成模型。2.2  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按雌雄、體重分層隨機(jī)分為6組，每組

5、36只，每天灌胃一次，每周復(fù)查體重，調(diào)整給藥量。共飼養(yǎng)4周，分別于7天、14天、28天3個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材，每次處死12只動(dòng)物。分組：正常對(duì)照組、模型組、潑尼松組（5.4mg/kg）、參龍煎劑低劑量組（生藥量0.675g/ml）、參龍煎劑中劑量組（生藥量1.2g/ml）、參龍煎劑高劑量組（生藥量2.4g/ml）。正常組、模型組建模后第2日起每日予以1ml/kg生理鹽水灌胃。其余各組按配好的藥品以等容藥品灌胃。2.3  標(biāo)本的制備  腹主動(dòng)脈放血至死，剖開(kāi)胸腔和頸部，分離氣管和肺臟，取下肺葉，用冰鹽水洗去血渣，剔除結(jié)締組織，濾紙吸干。稱(chēng)重后，同時(shí)結(jié)扎右主支氣管，從肺門(mén)部離斷，右肺上

6、葉用定量輸液泵小心灌入含有1/1000DFFC4%多聚甲醛溶液在25cmH20壓力下進(jìn)行灌注固定，切成1.5×1.5×1cm3大小，30分鐘后投入多聚甲醛溶液固定一周。取固定好的組織，在橫頸最大處3mm后組織片，常規(guī)脫水，二甲苯透明，用自動(dòng)石蠟包理機(jī)。切面4um的切片。備做HE、MASSON染色、光學(xué)顯微鏡下觀察。2.4  病理形態(tài)學(xué)定量分析 用BI-2000圖像分析系統(tǒng)對(duì)HE染色病理切片進(jìn)行光密度（OD值）測(cè)定。掃描時(shí)將切片分為3個(gè)區(qū)域：肺泡腔內(nèi)無(wú)組織結(jié)構(gòu)，OD值最低，定為無(wú)染區(qū)，其面積代表肺泡腔的面積；細(xì)胞核的OD值最高，定為深染區(qū)，其面積反映炎癥細(xì)

7、胞浸潤(rùn)程度；細(xì)胞外基質(zhì)和炎癥滲出染色較細(xì)胞核淺，HE切片中為粉色或淺粉，定為淺染區(qū)，與肺泡炎階段炎性水腫和滲出的區(qū)域基本一致，在模型晚期其面積主要反映細(xì)胞外基質(zhì)沉積程度。將切片置于圖像掃描分析儀顯微鏡下，在放大200倍條件下，每張切片分別從四周和中間隨機(jī)選5個(gè)視野，測(cè)定深染區(qū)、淺染區(qū)和無(wú)染區(qū)所占的面積。2.5  利用HE染色的病理切片，確定肺泡炎等級(jí)判定方法病變程度確定根據(jù)Szapiel等的方法確定肺泡炎和肺纖維化的程度。利用HE染色的病理切片將肺泡炎分為四級(jí)：（）無(wú)肺泡炎；（+）輕度肺泡炎，單核細(xì)胞浸潤(rùn)面積20%，結(jié)構(gòu)正常。（+）中度肺泡炎受累面積20%50%。（+）重度肺泡炎，受

8、累面積50%。         2.6  利用Masson氏三色染色的病理切片，確定肺纖維化等級(jí)判定方法根據(jù)Szapiel等的方法，分為四級(jí)：0級(jí)：無(wú)肺間質(zhì)纖維化（）；1級(jí)：輕度肺間質(zhì)纖維化（+），病變范圍局限在全肺20%以下；2級(jí)：中度肺間質(zhì)纖維化（+），病變范圍占全肺20%50%，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂。2.7  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件單因素方差分析（one Way Anova），統(tǒng)計(jì)結(jié)果用（x±s）表示。3  實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1  肉眼觀

9、察肺組織外觀形態(tài)正常組大鼠雙肺呈淡紅色，表面光滑，灌洗時(shí)彈性好，未見(jiàn)出血點(diǎn)。7天時(shí)，造纖維化模型各組均有明顯增大，質(zhì)地堅(jiān)硬，顏色鮮紅，并見(jiàn)肺組織輕度充血，表面出血點(diǎn)增加，以模型組最為嚴(yán)重。14天、28天后，模型組表現(xiàn)雙肺體積略縮小，質(zhì)地硬，顏色暗紅，表面粗糙不平，可見(jiàn)小片狀、凸凹不平蒼白灶，灌洗時(shí)彈性減弱，表面出血點(diǎn)散在，并見(jiàn)瘀斑。參龍煎劑各組肺組織顏色粉紅色，表面略粗糙，灌洗時(shí)彈性尚好，體積無(wú)明顯縮小，偶見(jiàn)出血點(diǎn)。激素組肺組織呈粉紅色，表面光滑，灌洗時(shí)彈性好。3.2  肺組織病理形態(tài)觀察HE染色可見(jiàn)各造模組均有程度不等的肺泡炎，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)有不等的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以巨噬細(xì)胞、淋巴

10、細(xì)胞及少量的中性粒細(xì)胞為主，模型組最明顯，而參龍煎劑中劑量組治療效果最好。（見(jiàn)圖2）MASSON染色中造模各組肺間質(zhì)、支氣管壁和肺泡隔膠原染色中膠原纖維明顯增多，以模型組最多。7天時(shí)膠原纖維主要分布于細(xì)小支氣管及小血管周?chē)?，肺泡間質(zhì)散在的膠原纖維，膠原纖維較短，尚未形成片狀及束狀；14天時(shí)，小氣管、小血管膠原纖維明顯增多，支氣管偶見(jiàn)少量束狀膠原纖維，肺間質(zhì)膠原纖維呈束狀或小片狀分布；28天時(shí)，支氣管、小支氣管、小血管大量膠原纖維環(huán)繞，周?chē)z原增生并向肺間質(zhì)延伸在間質(zhì)沉積，呈片狀、束狀，但治療組病變程度均要比模型組輕。3.3  各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)HE切片深染區(qū)比較情況結(jié)果顯示：HE染色

11、病理切片深染區(qū)面積代表炎性浸潤(rùn)：正常組大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的深染區(qū)面積明顯小于其它各組。P0.05或P0.01；模型組炎性浸潤(rùn)隨時(shí)間的推移，逐漸減低，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都大于中劑量和激素組有明顯的差異，P0.05或P0.01；參龍煎劑各個(gè)劑量組深染區(qū)的面積也有逐漸減少的趨勢(shì)，且以中劑量增加減少幅度最大，14天、28天與高劑量、低劑量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05，且與激素組效果相似；各個(gè)時(shí)間點(diǎn)參龍煎劑各個(gè)劑量均呈量效關(guān)系趨勢(shì)（見(jiàn)表1、圖1）表1  各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)HE切片深染區(qū)比較（略）注：P0.05 compared with N；P0.01 compared with N；P0.05 compare

12、d with M；P0.01compared with M；P0.05 compared with MD。3.4  肺泡炎、肺纖維化分級(jí)比較（見(jiàn)表2）。表2 各個(gè)時(shí)間點(diǎn)肺泡炎及肺纖維化分級(jí)比較（略）4  討論肺部的病理組織形態(tài)改變是最直觀的療效衡量標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠肺臟從外觀可見(jiàn)明顯的充血、水腫、瘀點(diǎn)瘀斑、肺組織明顯增大、質(zhì)硬，而參龍煎劑各組肺組織形態(tài)明顯好于模型組。肺組織輕度充血、水腫，肺組織增大、質(zhì)略硬。與激素組比較，色澤較深、較粗糙、較大。從光鏡檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，模型組肺組織可見(jiàn)明顯的炎癥及纖維化的改變，早期大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺組織大量充血、水腫；晚期，纖維化

13、沉積。參龍煎劑組肺部病變程度顯著減輕、病變范圍局限。無(wú)論是外觀還是光鏡下的檢測(cè)情況，均可見(jiàn)肺泡炎和纖維化，這證明了參龍煎劑對(duì)肺纖維化有積極的干預(yù)作用，從而表明了其可靠的治療效果。病理形態(tài)半定量分析，把切片從整體上進(jìn)行平均炎癥浸潤(rùn)程度、纖維化程度及正常肺組織面積來(lái)判定。經(jīng)參龍煎劑治療的大鼠的肺泡腔面積顯著增加（即無(wú)染區(qū)增加）而代表肺泡炎的深染區(qū)面積和代表纖維沉積的淺染區(qū)面積明顯減少，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與模型組差異顯著。肺組織的等級(jí)資料分析，是對(duì)肺泡炎及纖維化個(gè)數(shù)判定的指標(biāo)。通過(guò)分析，模型組多呈中、重度肺泡炎或纖維化改變，而參龍煎劑各個(gè)劑量組合激素組則多呈輕、中度肺泡炎或肺纖維化改變，與激素組比較無(wú)明顯

14、差異。通過(guò)這兩種方法的分析，可能說(shuō)明了參龍煎劑起到了抑制肺泡炎的加重，抑制了膠原纖維的沉積，減緩了肺纖維化的進(jìn)程，減輕了肺纖維化的病變程度。5  小結(jié)目前，我們所采用的方法復(fù)制出的只是一種藥物性肺纖維化，不論從發(fā)病機(jī)制還是療效評(píng)價(jià)，都有一定的局限性，且樣本較小，治療時(shí)間短，還不能全面、充分的反映出臨床上的錯(cuò)綜復(fù)雜的情況。在今后，自發(fā)性動(dòng)物疾病近似于人類(lèi)疾病，所以要大力開(kāi)展自發(fā)性動(dòng)物模型的探尋工作。現(xiàn)在，中醫(yī)藥的治療尚在初步階段，并且有很好的前景，相信在今后我們能充分利用中醫(yī)的優(yōu)勢(shì)來(lái)對(duì)自發(fā)性動(dòng)物模型進(jìn)行研究實(shí)驗(yàn)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Crystal RG,Bitterman PB,Rennerds letal .interstitial lung diseases of causes:disorders characterized by chronic inflammation of theolwer respiratory tract.N EI Jmed :1984,310:154166. 趙洪文，彭 璐肺纖維化大鼠BALF中細(xì)胞成分和肺組織病理的動(dòng)態(tài)研究J中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，26（5）：463466 柴文戌，李永春，劉玉玲，等博萊霉素大鼠致肺纖維化形態(tài)學(xué)變化的實(shí)驗(yàn)研究J中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2003，11（2）：7780 Szapiel