質(zhì)粒DNA的提取實(shí)驗(yàn)

1、試驗(yàn)六 質(zhì)粒DNA的提取一、試驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)本試驗(yàn)學(xué)習(xí)和把握堿裂解法提取質(zhì)粒二、試驗(yàn)原理質(zhì)粒(Plasmid)是獨(dú)立于染色體外的，能自主復(fù)制且穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。它是一種環(huán)狀的雙鏈DNA分子，存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動(dòng)植物細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。本試驗(yàn)利用SDS堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。將細(xì)菌懸浮液暴露于高pH值的強(qiáng)陰離子洗滌劑中，會(huì)使細(xì)胞壁裂開(kāi)，染色體DNA和蛋白質(zhì)變性，將質(zhì)粒DNA釋放到上清中。在裂解過(guò)程中，細(xì)菌蛋白質(zhì)、裂開(kāi)的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會(huì)相互纏繞成大型復(fù)合物，后者被SDS（十二烷基硫酸鈉）包蓋。當(dāng)用K+取代Na時(shí)，這些復(fù)合物會(huì)從溶液中有效地沉淀下來(lái)。離心除去變性劑后，就

2、可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒DNA。三、試驗(yàn)材料與試劑1、試驗(yàn)材料 大腸桿菌（含有攜帶插入片段的質(zhì)粒PMD-18T）2、試驗(yàn)試劑 (1) 溶液：Tris·HCl(pH8.0)25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L； (2) 溶液(新穎配制) ：NaOH 0.2mol/L,SDS 1%(W/V)； (3) 溶液(100ml)：5mol/L乙酸鉀60ml,冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml； (4) 氯仿異戊醇（24：1）； (5) 異丙醇、70%乙醇；四、試驗(yàn)步驟（一）提取質(zhì)粒1. 挑轉(zhuǎn)化后的單菌落(含PMD-18T質(zhì)粒)，接種到2

3、0ml含有適當(dāng)抗生素(Amp)的豐富培育基中(LB培育液)，于37猛烈振搖下培育過(guò)夜。（由老師完成）2. 將1.5ml的培育物倒入1.5ml的EP管中，于4 以12000rpm離心1min。3. 離心結(jié)束, 棄去上層培育液，再向離心管中加入1.5ml的培育物，于4 以12000rpm離心1min。4. 棄去上層培育液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。5. 將細(xì)菌沉淀重懸于100l冰預(yù)冷的溶液中,用Tip吸頭吹打沉淀至完全混勻(無(wú)塊狀懸浮)。6. 加200l新配制的溶液于每管細(xì)菌懸液中,蓋緊管口,快速顛倒離心管5次,以混合內(nèi)容物,留意動(dòng)作肯定要輕柔緩和，切勿振蕩!將離心管放置于冰上(2min)。7. 加1

4、50l用冰預(yù)冷的溶液III,蓋緊管口,反復(fù)顛倒數(shù)次,使溶液在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻,之后將管置于冰上35min。8. 4 以12000rpm離心5 min,將上清液（400 l ）轉(zhuǎn)移到另一離心管中。9. 加等體積的氯仿：異戊醇（24：1）振蕩混勻。 4 以12000rpm離心5min，將上清液（300 l ）轉(zhuǎn)移到另一離心管中。10. 加2/3體積的異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA,振蕩混勻,于冰上放置15min。11.4 以12000rpm離心5min。當(dāng)心吸去上清液，將離心管倒置于紙巾上，以使全部液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。12. 加1ml 70乙醇溶液洗滌沉淀，振蕩混勻, 4 12000

5、rpm離心5min。棄去上清液，在空氣中使DNA沉淀干燥（約5-10分鐘）。13. 用20l滅菌的蒸餾水溶解DNA,加1l胰RNA酶37 消化RNA 30min。14. 用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒的提取狀況。五、試驗(yàn)結(jié)果我組為第7組，由電泳圖譜可以看出，電泳得到3個(gè)條帶，條帶較為清楚。最前面的一條帶為超螺旋的質(zhì)粒DNA（分子量2000bp），中間的條帶為兩條鏈均發(fā)生斷裂而形成的線形DNA；最慢的條帶為一條鏈發(fā)生斷裂的開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA。六、思考題1. 試述在提取質(zhì)粒過(guò)程中溶液I、II、III的作用是什么?（1）溶液：Tris·HCl(pH8.0)25mmol/L,EDTA(pH8.0

6、)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L；主要作用是使細(xì)菌懸浮，此外EDTA 可抑制DNase的活性。(2) 溶液(新穎配制) ：NaOH 0.2mol/L,SDS 1%(W/V)；堿會(huì)使細(xì)胞壁裂開(kāi)，染色體DNA和蛋白質(zhì)變性，將質(zhì)粒DNA排放到上清中；在裂解過(guò)程中，細(xì)菌蛋白質(zhì)、裂開(kāi)的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會(huì)相互纏繞成大型復(fù)合物，可被SDS包蓋。(3) 溶液(100ml)：5mol/L乙酸鉀60ml,冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml；K+置換了SDS中的Na+，得到PDS（十二烷基磺酸鉀），這些復(fù)合物可以從溶液中有效地沉淀下來(lái)，經(jīng)離心除去。2. 描述質(zhì)粒DNA的電泳圖譜，并解釋產(chǎn)生的現(xiàn)象及可能的緣由？試驗(yàn)中得到的質(zhì)粒DNA電泳圖譜顯示共有三條帶，其中：最快的一條帶是超螺旋的質(zhì)粒DNA；中間的是線