蒼耳子提取物抗鴨乙型肝炎病毒作用的實驗研究

1、蒼耳子提取物抗鴨乙型肝炎病毒作用的實驗研究         【摘要】【關(guān)鍵詞】  蒼耳子提取物；鴨乙型肝炎病毒Abstract：ObjectiveTo study the effects of extract from Fructus Xanthii duck hepatitis B virus.MethodsOne-day old ducks infected with DHBV were used as the hepatitis B virus infected animal model. The

2、DHBV positive ducks were divided into 5 groups . Among the groups, three ones were treated with different concentrations of extract  from Fructus Xanthii（1，0.1 and 0.01 g·kg-1·d-1） for 10 days, control groups were treated with physiological saline and lamivudine(3TC, 2 mg·kg-1

3、83;d-1). ResultsThe high concentration of extract(1g·kg-1·d-1) could delay pathological changes of duck liver. But the three concentrations of extract had no effect on DHBV DNA in this experiment.ConclusionFructus Xanthii might delay pathological changes caused by Duck Hepatitis B Virus .K

4、ey words：Extraction from Fructus Xanthii;  Duck hepatitis B virus   全世界現(xiàn)有乙型肝炎病毒性（HBV）感染者約4億，每年50萬120萬人死于慢性HBV感染及其導(dǎo)致的肝硬化和肝癌1，研發(fā)有效地抗病毒藥物是當(dāng)前科研工作者的重要任務(wù)。我國中草藥資源豐富，毒副作用小，開展中草藥抗HBV研究將成為今后我國科研工作者的研究方向之一。蒼耳子始載于千金·食治，系菊科植物蒼耳Xanthium sibiricum Patr的成熟帶總苞果實，味辛苦，性溫，有毒。在抗病毒研究上，曾有用蒼耳子液治療扁平疣獲得較好

5、療效；姜克元2采用蒼耳子醇提取物研究其抗皰疹病毒作用，結(jié)果表明，蒼耳子提取液15稀釋可抑制病毒的生長，110稀釋可抑制100 TCID50。引起扁平疣的人乳頭狀病毒和皰疹病毒均屬DNA病毒，乙肝病毒的核酸為DNA，蒼耳子是否具有抗HBV的作用，本實驗選用中草藥蒼耳子提取物，利用雛鴨作為動物模型，研究蒼耳子提取物抗鴨乙型肝炎病毒的作用。1 材料   試劑與動物：蒼耳子提取物(本院自制)，鴨血清標(biāo)本、DHBV陽性血清、斑點雜交試劑 (重慶醫(yī)科大學(xué))，拉米夫定葛蘭素威康（蘇州）制藥有限公司；市售1日齡北京鴨。2 方法2.1 動物模型北京鴨經(jīng)腹腔注射0.1 ml陽性血清，9 d后取

6、血，分離血清，-70保存待檢。2.2 藥物治療2.3 檢測方法采用賴氏法測定血清ALT/AST活性，斑點雜交法測積分光密度光度值(IOD)，并取停藥3 d的鴨肝做病理切片，觀察組織學(xué)改變。2.4 統(tǒng)計學(xué)處理用藥組不同時間含量與用藥前比較，采用成組t檢驗；用藥組同一時間含量與病毒對照組比較，采用成組t檢驗。         3 結(jié)果3.1 鴨肝HE染色切片用藥前后的病理變化圖1為正常鴨肝細(xì)胞；經(jīng)DHBV感染后，鴨肝細(xì)胞（圖2）出現(xiàn)明顯空泡變性，胞漿疏松，匯管區(qū)可見炎細(xì)胞浸潤，有點狀出血、壞死；3TC鴨肝細(xì)胞（圖3）形

7、態(tài)正常；使用不同濃度蒼耳子提取物的雛鴨，其肝細(xì)胞（圖46）均有不同程度空泡變性、腫脹，部分可見匯管區(qū)及小葉間隔炎癥細(xì)胞浸潤，其中，蒼耳子提取物高劑量組肝細(xì)胞水腫程度較輕，好于病毒對照組，隨著蒼耳子濃度降低，肝細(xì)胞病變程度逐漸加重，蒼耳子提取物低劑量組肝細(xì)胞空泡變性程度較重，與病毒對照組無差異，并可見壞死、增生現(xiàn)象。3.2 T0，T5，T10及P3 鴨血清中DHBV DNA的變化將陽性雛鴨隨機(jī)分為5組，T0T5T10P3各時期用藥組與同期病毒對照組分別采血檢測血清中的DHBV DNA，斑點雜交實驗結(jié)果顯示：實驗期間病毒對照組血清中DHBV DNA量較穩(wěn)定，未見自然轉(zhuǎn)陰者；陽性藥物3TC組T5、T

8、10與T0比較DHBV DNA量明顯減少（P0.05），而P3 DHBV DNA有明顯反彈（P0.05）。蒼耳子提取物各組（1，0.1 ，0.01g·kg-1·d-1）對血清中的DHBV DNA無抑制作用（見圖7,表1，圖8）。表1  T0，T5，T10及P3血清中DHBV DNA 改變情況（略）4 討論   HBV感染抗病毒藥物的篩選需要進(jìn)行體內(nèi)實驗研究3。目前，鴨乙型肝炎病毒動物模型是衛(wèi)生部規(guī)定的新藥抗乙型肝炎病毒藥效學(xué)評價的唯一動物模型4。鴨乙型肝炎病毒與人類乙型肝炎病毒同屬嗜肝DNA病毒科，它們在形態(tài)、基因組結(jié)構(gòu)及復(fù)制方式上有相似之處，

9、鴨子是DHBV的自然感染宿主，感染后在病因或肝臟病理方面類似人類乙型肝炎5。DHBV感染雛鴨后9d，外周血DHBV上升，感染11 d達(dá)到高峰，至26 d才開始下降至較低水平。因此，適宜的給藥時間在15 d左右6，該時期的DHBV陽性雛鴨是用作藥物篩選理想的模型。本實驗在雛鴨體內(nèi)病毒血癥最穩(wěn)定的時間內(nèi)進(jìn)行，雖然最適給藥時間較短，但能夠模擬與人體感染HBV相似過程，我們認(rèn)為仍可提示研究藥物的抗HBV效應(yīng)。   HBV DNA是乙肝感染最直接、特異和靈敏的指標(biāo)，我們利用斑點雜交技術(shù)檢測鴨血清中DHBV DNA的表達(dá)，來判斷藥物治療效應(yīng)，結(jié)果提示，陽性對照藥3TC組在用藥期間能迅速

10、降低血清中DHBV DNA的水平，但停藥后病毒載量反彈明顯，該現(xiàn)象與其在治療HBV感染時的情況一致，其原因可能是7，8由于病毒感染了宿主細(xì)胞后，HBV mRNA和cccDNA整合在細(xì)胞核內(nèi)，而3TC不能清除核內(nèi)的mRNA和cccDNA。蒼耳子提取物組血清中DHBV DNA水平在用藥期間平穩(wěn)，表明蒼耳子提取物對DHBVDNA無抑制作用。   經(jīng)DHBV感染后，鴨肝細(xì)胞病理切片表現(xiàn)出明顯空泡變性，胞漿疏松，匯管區(qū)可見炎細(xì)胞浸潤，有點狀出血、壞死；經(jīng)3TC治療的鴨肝細(xì)胞形態(tài)正常，表明3TC組有明顯減輕鴨肝炎性改變的作用。不同濃度蒼耳子提取物治療后的鴨肝細(xì)胞，只有蒼耳子提取物高劑量

11、組肝細(xì)胞水腫程度較輕，好于病毒對照組，隨著蒼耳子濃度降低，肝細(xì)胞病變程度逐漸加重。說明蒼耳子提取物高劑量組對DHBV造成的病理改變有一定的減輕作用，但作用不如3TC組明顯。   本研究表明，蒼耳子提取物對延緩DHBV造成的病理改變有一定作用，對DHBV DNA無抑制作用，其機(jī)制仍需進(jìn)一步探討?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1Lok AS,McMahon BJ. Chronic hepatitis B.Hepatology,2007,45 (2):507.2姜克元, 黎維勇, 王 嵐. 蒼耳子提取液抗病毒作用的研究J.時珍國藥研究, 1997,8(3):217.3李常青, 劉妮.

12、 苦參堿脂質(zhì)體抗乙型肝炎病毒的體外實驗研究J. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2003, 3（1）:19.4陳壓西, 齊珍元, 黃愛龍. 堿性磷酸酶直接標(biāo)記核酸探針檢測血清中鴨乙型肝炎病毒DNA方法的建立及應(yīng)用J. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2003,28（3）: 140.5胡權(quán)，楊東亮.鴨乙型肝炎病毒感染模型的研究進(jìn)展J.實用肝臟病雜志, 2007,10(3):201.6Lian Y, Tan J, Deng Z. Experimental study of shuangcao granule no.1 on duck hepatitis B virus in ducklingsJ. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine, 2000,20(7): 530.7蘇海濱, 王慧芬, 季偉, 等. 拉米夫定與單磷酸阿糖腺苷聯(lián)合應(yīng)用抗-HBV的體外實驗研究J. 中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志, 2002, 16（1）:16.8Zou