人肺癌裸小鼠模型活體成像的動態(tài)觀察

1、人肺癌裸小鼠模型活體成像的動態(tài)觀察閆明霞1，吳海燕2，朱淼鑫1，劉蕾1，莢德水1，孔韓衛(wèi)1，姚明1 （1.上海市腫瘤研究所實驗病理研究室，上海 200032；2.揚州大學，揚州 225009）摘要 目的：建立穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的人肺癌細胞系，并探討小動物活體熒光成像系統在皮下移植瘤模型中的應用。方法：應用慢病毒轉染的方法建立表達綠色熒光蛋白的人肺癌細胞系NCI-H460-GFP,并接種至裸小鼠體內建立皮下移植瘤模型，通過小動物活體成像系統連續(xù)5周觀察腫瘤在動物皮下的動態(tài)生長情況。結果：建立了轉染率接近100%的NCI-H460-GFP細胞系，在體外及裸小鼠體內均能夠長期穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白。

2、活體熒光成像觀察發(fā)現：1-4周隨著腫瘤體積逐漸增大，平均熒光量子數也逐漸增加，5周時隨著腫瘤出現明顯壞死，平均熒光量子數呈現下降趨勢。結論：穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的NCI-H460-GFP細胞系及其動物模型可以為肺癌研究提供理想的實驗材料，應用小動物活體成像系統能夠客觀定量評價腫瘤在動物體內的生長情況。 關鍵詞 人肺癌；活體成像系統；裸小鼠；綠色熒光蛋白;慢病毒載體Dynamic observation of in vivo biofluorescence imaging of GFP-transfected human lung carcinoma in nude miceYAN Ming-x

3、ia1, Wu Hai-yan2,Zhu Miao-xin1,Liu Lei1, Jia De-shui1,Kong Han-wei1, YAO Ming1 (1. Department of Experimental Pathology，Shanghai Cancer Institute，Shanghai 200032，China；2. College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)ABSTRACT Objective：To establish a human lung carcinom

4、a cell line, which can stably express green fluorescent protein, and discuss the application of in vivo biofluorescent imaging system in animal model. Methods：Human lung carcinoma NCI-H460 cells were tranfected with gfp gene by lentiviral vector, and they were transplanted into the subcutaneous of t

5、he nude mice for preparing the tumor-bearing mice. The biofluorescent signals were detected in sequential five weeks using in vivo fluorescent imaging system. Results：We had successfully built up a human lung carcinoma NCI-H460-GFP cell line, which can display stable high-level GFP expression in vit

6、ro and in vivo. In vivo fluorescent images showed that the fluorescent intensities gradually increased with the increase of tumor volume in nude mice from one week to four weeks, whereas fluorescent intensities didnt agree with caliper-measured tumor volume in the fifth week. Conclusions：This high G

7、FP-expressing cell line and animal model may be useful for the study of lung carcinoma, and in vivo fluorescent imaging system was fitted for evaluation and quantitation of the tumor growth. KEY WORDS： Human lung carcinoma; In vivo imaging system; Nude mice； Green fluorescent protein; lentiviral vec

8、tor活體成像技術是近幾年新興的一項技術，它是利用活體生物發(fā)光或熒光成像技術直接監(jiān)測活細胞在動物體內的生物學行為及跟蹤分子信號，是檢測實驗動物體內細胞及分子事件的強有力手段，目前已成為醫(yī)學、生物學及藥物開發(fā)等1-5研究領域發(fā)展最迅速的前沿技術。國內在活體成像技術方面的工作剛剛起步，相關技術尚不成熟。本實驗旨在建立穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的人肺癌NCI-H460-GFP細胞系的基礎上，應用活體成像技術動態(tài)觀察細胞在體內、外的熒光表達情況，為肺癌的深入研究提供理想的實驗材料及客觀的參考依據。1 材料與方法1.1 材料1.1.1人肺癌細胞株人非小細胞肺癌細胞株NCI-H460來源于國家癌基因及相關基因重

9、點實驗室，該細胞在體外用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進行常規(guī)培養(yǎng)。1.1.2實驗動物SPF級BALB/cnu/nu裸小鼠7只，68周，體重1822g，雄性，由上海市腫瘤研究所提供實驗動物生產許可證號為SCXK(滬)20070001，實驗操作及動物飼養(yǎng)嚴格按照SPF級標準要求進行實驗動物使用許可證號為SYXK(滬)20070001。1.1.3儀器和試劑小動物活體熒光成像系統購自德國Berthold Technologies GmbHCo.KG，型號為LB983 NC320，分析軟件為WinLight32。熒光顯微鏡購自OLYMPUS公司。來源于人類免疫缺陷病毒（HIV-1）的慢病毒載體系統的

10、3種包裝質粒PWPXL-GFP、PAX2、PMD2G均來自tronolab公司。胎牛血清購自HyClone公司（Lot No.：NSF0050），培養(yǎng)皿及培養(yǎng)板等購自Greiner Bio-one GmbH。1.2 方法1.2.1 細胞轉染病毒包裝：將293T細胞鋪于10cm培養(yǎng)皿，每10cm培養(yǎng)皿含2-2.5106個細胞，第二天進行細胞轉染。3種質粒PWPXL-GFP 20g，PAX2 15g， PMD2G 6g加水至500ul，加入500ul 2xHBS，混勻。加入50ul 2.5M CaCl2，輕輕混勻，室溫放置20-25分鐘后滴加入培養(yǎng)基中。6-8小時后，更換培養(yǎng)基。第四天收集培養(yǎng)基，

11、3000rpm室溫離心5分鐘，0.45 m濾膜抽濾。病毒可直接用于轉染或-70度保存。病毒感染：將NCI-H460細胞鋪于24孔板，每孔2104個細胞。將Polybrene 加入24孔板中，終濃度為4g/ml。加入慢病毒，MOI=1000。熒光顯微鏡觀察細胞綠色熒光蛋白表達。1.2.2穩(wěn)定轉染細胞的活體熒光成像檢測取生長旺盛的穩(wěn)定轉染細胞，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）常規(guī)消化，計數后調整細胞濃度，按50l體積含10，100，1000，1104，5104，1105，5105，1106個細胞依次滴加于黑色遮光紙，活體熒光成像系統（發(fā)射波長為520nm，激發(fā)波長為480nm，曝光時間

12、為1s）檢測各細胞濃度的熒光表達情況。1.2.3 腫瘤體內生長的活體熒光成像觀察收集生長旺盛的連續(xù)傳代細胞，調整細胞濃度為1107個/ml，分別取0.2ml接種于3只裸小鼠右背側近腋部皮下。當皮下移植瘤長至直徑約10左右時剝取出移植瘤，剔除纖維包膜及出血壞死部分，切取生長良好、淡紅色、魚肉狀的瘤組織，將其剪切成若干1.51.51.5的小塊，用20號套管針將腫瘤小塊逐個移植至其他4只裸小鼠皮下，從而建立皮下移植瘤模型。每周游標卡尺測量皮下移植瘤直徑，計算移植瘤體積并繪制腫瘤生長曲線。使用小動物活體成像系統檢測GFP表達的發(fā)射波長為520nm，激發(fā)波長為480nm，曝光時間為1s。每周觀察皮下移植

13、瘤生長情況，并定量分析各時間點的熒光值，連續(xù)觀察5周。以腫瘤接種天數為橫坐標，腫瘤接種部位單位面積熒光值為縱坐標，繪制皮下腫瘤生長曲線。1.2.4統計學處理將所有數據用SAS8.2軟件進行處理，相關性采用SPEARMAN等級相關進行分析，雙側檢驗水準為0.05。計量資料以均值標準差（s）表示。熒光值按公式：平均熒光量子數=總量子數/熒光面積進行計算。移植瘤體積按公式：V=ab2 /2(V為瘤體積，a為長徑，b為短徑) 進行計算。2 結果2.1 GFP標記的腫瘤細胞GFP標記的NCI-H460細胞為多邊形上皮樣細胞，貼壁生長，熒光顯微鏡觀察可見細胞表達的熒光信號較強，熒光較為均勻地分布于整個細胞

14、內，轉染率接近100%，細胞在體外能夠穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白，并且隨體外長期傳代培養(yǎng)無明顯消退（圖1）。 圖1 穩(wěn)定高表達GFP的NCI-H460-GFP細胞(A) NCI-H460-GFP細胞熒光圖（200） (B) NCI-H460-GFP細胞明場圖（200）Fig1 Stable and highlevel GFP expression NCI-H460-GFP ceils in vitro(A)Image of NCI-H460-GFP cells visualized with an inverted fluorescence microscopy(200magnification).

15、 (B)Image of (A) visualized with an inverted microscopy(200magnification).2.2活體熒光成像檢測NCI-H460-GFP的體外表達通過活體熒光成像系統觀察NCI-H460細胞不同濃度的熒光表達，結果可見：該成像系統能夠檢測的最小細胞數為100個腫瘤細胞，儀器靈敏度較高，隨著細胞濃度的遞增，熒光表達的強度也逐漸增加，即平均熒光量子數與細胞濃度成正比(圖2)。A B C圖2 活體熒光成像系統觀察不同濃度細胞的綠色熒光蛋白表達(A)不同濃度NCI-H460-GFP細胞活體成像偽彩圖 (B) 不同濃度NCI-H460-GFP細胞

16、活體成像軟件分析參考圖 (C) 不同濃度NCI-H460-GFP細胞熒光定量Fig.2 GFP expression of NCI-H460 with different cells concentrations in vitro observed by in vivo biofluoresent imaging system(A)Pseudo-color image of NCI-H460-GFP cells with different cells concentration .(B)Reference image of dimensional distribution and relat

17、ive amplitude of fluorescence drown by Winlight 32 software. (C) Quantification of fluorescence of NCI-H460-GFP cells. 2.3活體熒光成像動態(tài)觀察NCI-H460-GFP皮下移植瘤的生長NCI-H460-GFP皮下移植瘤的生長潛伏期約5天，1周時腫瘤大小不能用游標卡尺測量，2周時腫瘤進入對數生長期，至5周時移植瘤體積可達（3782.00852.89）3，4只動物皮膚表面都出現了不同程度的壞死。應用小動物活體熒光成像系統可監(jiān)測到綠色熒光在裸小鼠皮下的穩(wěn)定表達，從第1周至第4周，隨

18、著腫瘤移植時間的增加，表達綠色熒光的面積逐漸增大，熒光量子數也逐漸增加，移植瘤體積與熒光量子數成正相關（R=0.86713,P0.05）（圖3，4，5）。 1w 2w 3w 4w 5w圖3 活體熒光成像動態(tài)檢測NCI-H460-GFP細胞在裸小鼠體內的表達Fig.3 Dynamic observation of in vivo biofluorescent imaging of the NCI-H460-GFP tumor in four nude mice from 1 week to five weeks圖4 NCI-H460-GFP的腫瘤生長曲線與與熒光值的動態(tài)變化Fig. 4 The

19、tumor growth curve of NCI-H460-GFP and dynamic change of biofluorescence圖5腫瘤體積與熒光值的相關性分析Fig. 5 The correlation analysis between tumor volume and biofluorescence during tumor proliferation討論活體熒光成像技術自從出現以來已經成為了生命科學和醫(yī)學研究的強有力的手段。與之密切相關的活細胞標記技術也得到了越來越快速的發(fā)展。1994年Chalfie6等首次在大腸桿菌和線蟲中表達了GFP，開創(chuàng)了GFP應用研究的先河，近年

20、來，綠色熒光蛋白已成為應用最為廣泛的標記性蛋白質之一。與-半乳糖苷酶（LacZ）、螢火蟲熒光素酶（Luc）等報告基因相比，gfp基因表達的綠色熒光蛋白受到藍光或紫光照射時可自發(fā)地發(fā)出綠色熒光，熒光信號強度高，易于被捕獲，無需其他底物或輔助因子的協助便可直接通過活體成像系統、激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀等進行檢測，觀察極其直觀方便7。此外，它還具有穩(wěn)定性好、耐受性強、對組織或細胞無毒性、易于構建載體等優(yōu)點。因此，GFP在腫瘤的生長、藥效評價和基因治療等方面都得到了廣泛的應用。但是，由于GFP的發(fā)射波長較短因而穿透力稍差，在腫瘤應用研究的某些方面仍然存在一定局限性。如YANG等8認為熒光的強弱與腫

21、瘤大小、深度有關，淺表部位可以檢測到的最小病灶為59m；而深部腫瘤由于受到周圍組織的干擾，小的病灶常難以顯示。Caceres等9也證實GFP標記的腫瘤細胞適合于對淺表部位的腫瘤進行成像研究，而熒光素酶標記的細胞適合于對深部組織的原發(fā)與遠處轉移灶進行研究?；蜣D染技術是分子生物學的常用技術之一，轉染所用載體主要包括病毒載體（逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒等）和非病毒載體（脂質體、DEAE-葡聚糖、磷酸鈣共沉淀、電穿孔等）。慢病毒( lentivirus)屬逆轉錄病毒亞屬,具有能夠轉染分裂和非分裂的細胞、目的基因整合入靶細胞穩(wěn)定表達治療基因,無明顯免疫反應等特性,同時能夠轉染廣泛的組織、能夠被濃縮成高

22、滴度等優(yōu)點10。脂質體載體最主要的優(yōu)點是介導的目的基因大小不受限制、無生物源性和毒性，更安全可靠。但是它的轉染效率較低，轉染效果不穩(wěn)定，在動物體內缺少G418的選擇壓力作用下只能短暫表達，隨著新的腫瘤細胞的不斷復制分離，表達的熒光強度會逐漸衰退。本實驗以來源于人類免疫缺陷病毒-1（HIV-1）的慢病毒為載體，成功建立了能夠在體外和體內都能穩(wěn)定、長期、高效表達綠色熒光蛋白的NCI-H460-GFP細胞，為活體熒光成像系統的進一步應用打下了堅實的基礎。 活體動物體內光學成像技術具有極高的靈敏度，對疾病動物模型微小病灶的檢測靈敏度極高；該技術能夠進行無創(chuàng)、實時、動態(tài)的動物活體觀察，從而對同一實驗對象

23、進行不同時間點的觀察，減少實驗動物個體間差異，與傳統的實驗方法相比，可以大大減少動物的用量，符合替代、減少、優(yōu)化的“3R”原則。本實驗在成功建立表達綠色熒光蛋白的人肺癌細胞系NCI-H460-GFP的基礎上，使用活體成像系統對不同濃度的細胞進行了體外熒光表達檢測，結果發(fā)現100個細胞就可以檢測到，說明成像系統具有較高的檢測靈敏度。通過連續(xù)動態(tài)觀察NCI-H460-GFP在裸小鼠體內的生長情況，發(fā)現成像系統在腫瘤皮下移植7天時就可以檢測到熒光的表達，此時按傳統方法尚無法測量移植瘤體積。隨著移植瘤體積的不斷增加，成像系統可以通過平均量子數客觀地描述腫瘤的生長，所得數據與游標卡尺測量的腫瘤體積相對應

24、。至5周時瘤體表面出現壞死以后，盡管游標卡尺測量的腫瘤體積仍在增加，但成像系統所測的熒光量子數反而呈現下降趨勢，原因可能是GFP屬于報告基因只能在活細胞中才能表達?；铙w成像系統能夠更加準確地反應腫瘤生長的實際情況，有利于減小人為實驗誤差，所獲得的實驗結果更加直觀可靠。同時，應用該系統也可以使實驗動物的用量大為減少，節(jié)約了實驗成本，而且是以自身為對照動態(tài)追蹤腫瘤的生長變化，有效的排除了動物個體間差異的影響。 本實驗應用慢病毒轉染的方法成功建立了人肺癌NCI-H460-GFP細胞系，通過小動物活體成像系統檢測證實該細胞具有在體外和動物體內均能穩(wěn)定、持續(xù)、高效的表達綠色熒光蛋白的特點。另外，活體成像

25、系統具有較高的靈敏性，能夠客觀評價NCI-H460-GFP細胞在裸小鼠體內的生長情況，為成像系統的在肺癌的發(fā)展機理、藥物治療、基因治療等方面研究提供重要的參考依據。 致謝：真誠感謝“國家癌基因及相關基因重點實驗室”李宗海副研究員對本實驗的指導和幫助。參考文獻：1 ANDY J. MINN,GAORAV P. GUPTA,PETER M.SIEGEL, et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lungJ.Nature,2005,436:518-524.2EBEN L.ROSENTHAL,BRIAN D.KULLBERSH,TER

26、ESA KING, et al. Use of fluorescent labeled antiepidermal growth factor receptor antibody to image head and neck squamous cell carcinoma xenograftsJ. Molecular Cancer Therapeutics，2007,6（4）：12301238.3KENSUKE YAMAUCHI,MENG YANG,PING JING, et al. Development of real-time subcellular dynamic multicolor

27、 imaging of cancer-cell trafficking in live mice with a variable-magnification whole-mouse imaging systemJ.Cancer Res,2006,66(8): 4208-6214.4 TERESA GARCIA, AMANDA JACKSON,RICHARD BACHELIER, et al. A convenient clinically relevant model of human breast cancer bone metastasis J. Clinical & Experiment

28、al metastasis, 2008,25(1):33-42.5 SOHAIL F. TAVAZOIE,CLAUDIO ALARCON,THORDUR OSKARSSON, et al. Endogenous human microRNAs that suppress breast cancer metastasis J.Nature,2008,451:147-152.6CHALFIE M, TU Y, EUSKIRCHEN G, et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression J.Science, 1994,263: 802-805. 7PAUL T. WINNARD JR, JESSICA B. KLUTH, VENU RAMAN. Noninvasive optical tracking of red fluorescent pro