引物純化方式選擇指南

1、容導(dǎo)讀一、DNA 合成的方法和原理二、引物純化的方法原理及其效果三、純化方法與應(yīng)用指南四、常見(jiàn)問(wèn)題的原因分析及相應(yīng)的對(duì)策一、DNA 合成的方法和原理 目前引物合成主要采用固相亞磷酰胺三酯法進(jìn)行。 基于該方法的 DNA 合成儀有多種， 由 ABI/PE 公司生產(chǎn)的高通量 DNA 自動(dòng)合成儀得到了廣泛的應(yīng)用。 各合成儀進(jìn)行引物合成的原理基本相同， 主要區(qū)別在于合成產(chǎn)率的高低、 試劑消耗量和單個(gè)循環(huán)用時(shí)等。 生工公司采用的合成儀主要機(jī)型 為全新的 ABI3900 高通量合成儀。固相亞磷酰胺三酯法合成 DNA 片段，具有高效、快速偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn)。該方法是在固相載體上完成DNA鏈的合成

2、的，DNA化學(xué)合成不同于酶促的DNA合成過(guò)程從53方向延伸，而是由 3端開(kāi)始，相鄰的核苷酸通過(guò)3t 5磷酸二酯鍵連接。具體的反應(yīng)步驟如圖一。1、脫保護(hù)基 (Deblocking) 用三氯乙酸 (Trichloroacetic Acid ， TCA) 脫去連結(jié)在 CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷 酸的保護(hù)基團(tuán) DMT ( 二甲氧基三苯甲基 )，獲得游離的 5-羥基端，以供下一步縮合反應(yīng)。2 、活化 (Activation)將亞磷酰胺保護(hù)的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并進(jìn)入合成柱，形成亞磷酰胺四唑活性中間體(其 3-端已被活化，但 5-端仍受 DMT 保護(hù) )，此中

3、間體將與 GPG 上的已脫保護(hù)基的核苷酸發(fā)生 縮合反應(yīng)。3 、連接 (Coupling)亞磷酰胺四唑活性中間體遇到 CPG 上已脫保護(hù)基的核苷酸時(shí)， 將與其 5-羥基發(fā)生親合反應(yīng)， 縮 合并脫去四唑，此時(shí)合成的寡核苷酸鏈向前延長(zhǎng)一個(gè)堿基。4 、封閉 (Capping)縮合反應(yīng)后， 為了防止連在 CPG 上的未參與反應(yīng)的 5-羥基在隨后的循環(huán)反應(yīng)中被延伸，常通過(guò)乙?；瘉?lái)封閉此端羥基，一般乙?；噭┦怯靡宜狒蚇-甲基咪唑等混合形成的。圖 1: DNA 合成原理示意圖(固相亞磷酰胺三酯法)5 、氧化 (Oxidation)縮合反應(yīng)時(shí)核苷酸單體是通過(guò)亞磷酯鍵與連在 CPG 上的寡核苷酸連接， 而亞磷

4、酯鍵不穩(wěn)定，易被酸、堿水解，此時(shí)常用碘的四氫呋喃溶液將亞磷酰轉(zhuǎn)化為磷酸三酯，得到穩(wěn)定的寡核苷酸。經(jīng)過(guò)以上五個(gè)步驟后，一個(gè)脫氧核苷酸就被連到 CPG 的核苷酸上，同樣再用三氯乙酸脫去 新連上的脫氧核苷酸 5-羥基上的保護(hù)基團(tuán) DMT 后，重復(fù)以上的活化、 連接、封閉、 氧化過(guò)程即 可得到DNA片段粗品。最后對(duì)其進(jìn)行切割、 脫保護(hù)基，合成的Oligo在脫去保護(hù)基后，目的Oligo純度是比較低的， 其中含有大量的雜質(zhì)。 主要雜質(zhì)有： 所脫下的保護(hù)基與氨形成的苯甲酸氨和異 丁酸氨，腈磷基上脫下的腈乙基，以及合成時(shí)產(chǎn)生的短鏈等。以至于粗產(chǎn)品中全長(zhǎng)Oligo DNA含量?jī)H為25%左右。盡管合成時(shí)每一步的效

5、率都在98%99%，但累積的效率并不高。這些雜質(zhì)成分，尤其是存在于粗產(chǎn)品中的大量鹽和短鏈，不但造成定量不準(zhǔn)，還會(huì)影響下一步的反應(yīng)。 因此必須對(duì) Oligo DNA 進(jìn)行純化、定量等合成后處理即可得到符合實(shí)驗(yàn)要求的寡核苷酸片段。二、引物純化的方法原理及其效果基于以上合成的原理和步驟， 目前， 常見(jiàn)的幾種純化方法如 C18 柱、 OPC 或 HAP、 PAGE 、 HPLC 。生工公司采用 HAP 、 ULTRA PAGE 、 HPLC 三種純化方法，其純化的原理及其效果分 別如下，我們建議客戶應(yīng)根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求，選擇合適、經(jīng)濟(jì)并有效的純化方法。1. HAP 純化方法HAP （ HighAffi

6、nityPurification ）是生工生物自主開(kāi)發(fā)的新型 oligoDNA 純化方法。該方法已 取得國(guó)家專利（專利號(hào)： 0.X ）。其原理是利用合成引物 5- 端 DMT 基團(tuán)對(duì) HAP 樹(shù)脂專一性吸 附，而不含 DMT 的短鏈 DNA 不被吸附，從而達(dá)到分離純化的目的。HAP 純化 柱中裝有對(duì) DMT 具有親和力的樹(shù)脂，合成 DNA 片段時(shí)保留 5端最后一個(gè)堿基 上的 DMT ，所有合成產(chǎn)物吸附在柱上以后，用稀的有機(jī)溶劑洗柱，帶有DMT 的片段吸附能力強(qiáng)，不易被洗脫，不帶有 DMT 的片段吸附能力弱，被洗脫。然后用三氟乙酸TFA 或三氯乙酸 TCA 脫去 DMT 基團(tuán)，再用濃一點(diǎn)的有機(jī)溶

7、劑洗脫 DNA 。這種方法具有多快好省的特點(diǎn)。 制品純度可達(dá)到 8090% ， 可以滿足雜交 探針 、 測(cè)序 、常規(guī) PCR （不再做進(jìn)一步克隆實(shí)驗(yàn)）等 用途了。但是因?yàn)槠鋵Ｒ恍晕?DMT 能力有限，不免仍然有短片段帶入的可能，而且負(fù)載量 小。特別是對(duì)長(zhǎng)于 39 堿基以上的片段純化效果不好。此 級(jí)別只提供長(zhǎng)度在 10-39mer 以下的合 成 oligo DNA 制品。序列更長(zhǎng)時(shí)，制品的純度得不到保證。若考慮節(jié)約經(jīng)費(fèi)，對(duì)于要求較低的實(shí) 驗(yàn)，如簡(jiǎn)單的 PCR 反應(yīng)，則采用 HAP 純化即可。2. ULTRA PAGE 純化方法PAGE （Polyacrylamide Gel Electroph

8、oresis），該方法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對(duì)DNA 片段進(jìn)行分離， 然后從凝膠中回收目的 DNA 的方法。 PAGE 純化基于尺寸和構(gòu)象分離全長(zhǎng) 產(chǎn)物和失敗序列，可以分離相差一個(gè)堿基的引物 （120 堿基以 ），從而提供高純度的引物。純化后 的DNA純度大于90%，相比與其他兩種方法，PAGE純化對(duì)長(zhǎng)鏈 Oligo DNA （大于50 mer）的純化特別有效，制品純度保證 90 95% 。如訂購(gòu)的 DNA 欲用作 RT-PCR 引物、各種探針，或 用于 PCR 克隆測(cè)序、定點(diǎn)突變等，請(qǐng)選用 PAGE 純化制品。ULTRA PAGE :理論上分析型 PAGE變性電泳，可以區(qū)分引物之間一

9、個(gè)堿基的差別。經(jīng)過(guò) PAGE純化的引物，特別是長(zhǎng)引物要的量都比較高，上樣量都是非常大，電泳時(shí)的條帶往往比較寬，帶與帶之間有重疊，分辨率有所下降，電泳后割帶回收目的引物時(shí)，導(dǎo)致割的條帶有時(shí)可能比較寬，很難避免割到差別僅一個(gè)或幾個(gè)堿基的引物。因此生工生物為了給客戶更好解決以上問(wèn)題，將原有的 PAGE純化方式升級(jí)優(yōu)化為現(xiàn)在的 ULTRA PAGE 純化方式，即在 PAGE純化的 同時(shí)配合質(zhì)譜對(duì) DNA進(jìn)行定性分析，以保證回收片段的正確性。3. HPLC純化方法HPLC （High Performa nee Liquid Chromatography）是使用高效液相色譜的原理，依據(jù)DNA的疏水性來(lái)分離

10、產(chǎn)物的。合成粗產(chǎn)物中不同長(zhǎng)度的DNA片段的疏水性不同，一般來(lái)說(shuō)較長(zhǎng)的片段具有較強(qiáng)的疏水性，AT含量高的片段也具有較強(qiáng)的疏水性。先將粗產(chǎn)物檢測(cè)主峰位置，再增加加樣量，回收主峰位置的部分。該方法用于分離純化時(shí)能達(dá)到很高的純度和靈敏度，可以有效的去除大部分 N-短片段，因而可以除去失敗序列或未結(jié)合的標(biāo)記物，從而對(duì)DNA片段進(jìn)行純化。同時(shí)配合質(zhì)譜對(duì) DNA進(jìn)行定性分析，以保證回收片段的正確性。由于HPLC產(chǎn)品的純度非常高，使用本法純化的DNA制品可適用于各種基因工程實(shí)驗(yàn)。主要用于PCR克隆、定點(diǎn)突變、人工合成基因、長(zhǎng)鏈和修飾引物的純化等。它的優(yōu)點(diǎn)是自動(dòng)化程度高、省人力；弱點(diǎn)是純化量通量小、成本較高。三

11、、純化方法與應(yīng)用指南表1: HAP、ULTRA PAGE 和HPLC 三種純化方法的特點(diǎn)比較純化方式純化原理優(yōu)缺點(diǎn)應(yīng)用HAP采用純化柱上特異性樹(shù)脂對(duì)DNA片段上保留 5端最后 一個(gè)堿基上的 DMT有親和 吸附作用從而達(dá)到分離純 化。多快好省的特點(diǎn)。純度可達(dá)到8090%，但是對(duì)長(zhǎng)于40堿基以上的片 段純化效果不好?？梢詽M足雜交探 針、測(cè)序、常規(guī) PCR （不再做進(jìn)一 步克隆實(shí)驗(yàn)）等用 途。ULTRA PAGE采用變性聚丙烯酰胺凝膠電 泳，基于凝膠的尺寸和 DNA 的構(gòu)象原理，可以分離相差 一個(gè)堿基的引物，從而達(dá)到 對(duì)全長(zhǎng)產(chǎn)物和失敗序列進(jìn)行 分離，然后從凝膠中回收目 的DNA ,同時(shí)配合質(zhì)譜對(duì) D

12、NA進(jìn)行定性分析，以保證 回收片段的正確性。純度好，準(zhǔn)確性高，對(duì)于較長(zhǎng) 序列（40-120 ），制品純度 保證9095%，相比與其他兩 種方法，ULTRA PAGE 純化 對(duì)長(zhǎng)鏈引物（大于50mer）的 純化特別有效，缺點(diǎn)需要跑電 泳并切膠回收，費(fèi)時(shí)費(fèi)力?？蛇m于多重PCR、 亞克隆、點(diǎn)突變、 各種探針，或用于 PCR克隆測(cè)序、定 點(diǎn)突變等。HPLC采用高效液相色譜的原理， 依據(jù)DNA的疏水性來(lái)分離 產(chǎn)物的。合成粗產(chǎn)物中不同 長(zhǎng)度的DNA片段的疏水 性不同，一般來(lái)說(shuō)較長(zhǎng)的片 段具有較強(qiáng)的疏水性，同時(shí) 配合質(zhì)譜對(duì)DNA進(jìn)行定性 分析，以保證回收片段的正 確性。該法自動(dòng)化程度高、省人力； 對(duì)于較長(zhǎng)片

13、段（大于89 mer）， 純化效果不如 ULTRA PAGE 方法好。盡管對(duì)于較長(zhǎng)序列， 但如果實(shí)驗(yàn)對(duì)制品的純度要 求非常高， HPLC 與ULTRA PAGE雙重精制會(huì)使效果更 佳，其弱點(diǎn)是純化通量小、成 本較高。因其HPLC產(chǎn)品的 純度非常高，使用 本法純化的 DNA 制品可適用于各 種基因工程實(shí)驗(yàn)。主要用于PCR克 隆、定點(diǎn)突變、人 工合成基因、長(zhǎng)鏈 和修飾引物的純 化。對(duì)40 mer以下的DNA制品，HPLC是最好的純化方法， 其次是ULTRA PAGE ；而對(duì)40 mer 以上的DNA制品ULTRA PAGE 純化要優(yōu)于單純的 HPLC純化。所以，如您要對(duì) PCR產(chǎn)物 克隆后測(cè)序，一

14、定要選擇 ULTRA PAGE 純化或HPLC純化的引物。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求，您可以選用以下適合的純化方法，具體見(jiàn)表2表2: HAP、ULTRA PAGE 和HPLC 三種純化方法的應(yīng)用應(yīng)用引物長(zhǎng)度要求純化方法要求普通 PCR/RT-PCR40baseULTRA PAGE多重PCR/定量 PCR根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定ULTRA PAGE, HPLC測(cè)序根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定HAP診斷PCR擴(kuò)增根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定HAP, ULTRA PAGE亞克隆，點(diǎn)突變根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定ULTRA PAGE, HPLC基因構(gòu)建根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定ULTRA PAGE, HPLC全基因合成根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定HAP反義核酸根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定HPLC修

15、飾/標(biāo)記引物根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定HPLCPCR產(chǎn)物用于克隆表達(dá)研究或 基因重組等根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定ULTRA PAGE, HPLC四、常見(jiàn)問(wèn)題的原因分析及相應(yīng)的對(duì)策Q-1.拿到引物后，想在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)純度，如何實(shí)現(xiàn)？A-1:實(shí)驗(yàn)室可通過(guò)變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行引物純度的檢測(cè)：使用加有7M尿素的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，堿基數(shù) 12個(gè)的引物用20%的膠，12-60個(gè)堿基的引物用16%的膠，60個(gè)堿基的引物用12%的膠。取0.2-0.5 OD的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性（95 C，2 min ）。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進(jìn)行

16、電泳，一定時(shí)間后（約2-3小時(shí)），剝膠，用熒光 TLC板在紫外燈下檢測(cè)帶型，在主帶之下沒(méi)有雜帶，說(shuō)明純度是好的（有時(shí)由于變性不充分，主帶之上可能會(huì)有條帶，是引物二級(jí)結(jié)構(gòu)條帶)Q-2. 測(cè)序發(fā)現(xiàn)引物有突變或缺失是什么原因？A-2: 測(cè)序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)有突變，主要考慮三個(gè)方面的原因：測(cè)序， PCR/ 克隆過(guò)程，引物本身。A、測(cè)序引入的錯(cuò)誤對(duì)于 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行的克隆而言，無(wú)論是 TA 克隆或酶切克隆，引物區(qū)往往位于載體兩端， 如果用載體引物進(jìn)行測(cè)序， 此時(shí)克隆引物區(qū)離測(cè)序引物區(qū)的距離比較近， 處于測(cè)序起始階段或正 好處于測(cè)序染料峰所在的區(qū)域( 90-120 bp )，這兩個(gè)區(qū)域也是最容易產(chǎn)生測(cè)序錯(cuò)誤的

17、地方。因 此，首先要看原始的測(cè)序峰圖在引物區(qū)是否清晰， 堿基的錯(cuò)誤或缺失是否是由于峰圖不清楚而導(dǎo) 致的計(jì)算機(jī)誤讀。B 、 PCR/ 克隆過(guò)程盡管使用高保真聚合酶進(jìn)行 PCR 出錯(cuò)的可能性比較少， 但不排除 PCR 錯(cuò)配或者克隆過(guò)程中 突變的可能。有的人會(huì)問(wèn)， PCR 的突變?cè)趺磿?huì)出現(xiàn)在引物區(qū)呢？這是因?yàn)?，引物是單鏈，PCR產(chǎn)物引物區(qū)的互補(bǔ)鏈同樣是以引物為模板進(jìn)行擴(kuò)增得到的，因此，有可能存在引物正確但其產(chǎn)物出錯(cuò)的情況。針對(duì)這種情況的解決方法是進(jìn)行測(cè)序時(shí)，請(qǐng)送 2-3 個(gè)獨(dú)立的克隆子進(jìn)行測(cè)序，這樣可以排除PCR 過(guò)程出錯(cuò)或克隆產(chǎn)生突變的情況。C、引物本身錯(cuò)誤如前面所述，引物合成是一種多步驟的化學(xué)反

18、應(yīng)，即使每一步合成效率達(dá)到99% ，仍有 1%的序列不能連接或錯(cuò)誤地連接下一個(gè)堿基，這些序列在經(jīng)過(guò)Capping 后脫離循環(huán)，成為缺堿基的失敗序列；對(duì)于 缺失突變 ，一般認(rèn)為是一般認(rèn)為是帶帽 (capping) 反應(yīng)不徹底造成的， Caping 反應(yīng)主要 是封閉極少數(shù) 5-羥基沒(méi)有參加反應(yīng)單體。 被封閉的引物， 在下一輪偶連時(shí)將不能繼續(xù)參與合成。 對(duì)于實(shí)驗(yàn)中測(cè)序發(fā)現(xiàn)的較常見(jiàn)堿基缺失的可能原因如下：1. 由于DNA合成是沿著3 f 5端方向?qū)A基逐個(gè)連接上去的，每連上一 個(gè)堿基，都需要經(jīng)過(guò) (Detritylation 、 Coupling 、 Capping 、 Oxidation) 一個(gè)循環(huán)

19、。 Coupling 是上一個(gè)堿基的 5-OH 與 下一個(gè)堿基的 3 活性部分發(fā)生反應(yīng)，該反應(yīng)的效率最高可達(dá) 99% ，即便如此， 仍有 1%的序列不能連接下一個(gè)堿基，這些序列在經(jīng)過(guò) Capping 后脫離循環(huán)，成為缺堿基的失敗序列；2. Capping 是將沒(méi)有連接上下一個(gè)堿基的 5-OH 乙酰化， Capping 的效率不可能達(dá)到 100% ， 沒(méi)有被乙?；?5OH 會(huì)進(jìn)一步發(fā)生反應(yīng)，造成中間缺堿基的失敗序列；3. Detritylation 是脫掉上一個(gè)堿基 5-OH 上的保護(hù)基，準(zhǔn)備連接下一個(gè)新堿基， Detritylation 的效率也不可能達(dá)到 100% ，沒(méi)有脫保護(hù)的 5-OH

20、 會(huì)跳過(guò)該循環(huán)而直接進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)， 造成中 間缺堿基的失敗序列；至于 插入突變 ，引物序列中往往是堿基重復(fù)，一般認(rèn)為，偶連過(guò)程中，正在偶連的部分堿基 發(fā)生丟失 DMT ，處于活性狀態(tài)的新堿基在沒(méi)有與上一個(gè)堿基反應(yīng)前發(fā)生自連，將會(huì)造成堿基重 復(fù)，故會(huì)發(fā)生插入同一堿基的突變的失敗序列。對(duì)于堿基置換的突變 ，產(chǎn)生的原因一般認(rèn)為是堿基不能 100% 脫保護(hù)，即引物上可能含有殘 留保護(hù)基團(tuán)，通常發(fā)生在 G 轉(zhuǎn)換成其它堿基。堿基 G 在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為烯醇異構(gòu)體 2,6-diaminopurine （脫嘌呤）， DNA 復(fù)制和 PCR 過(guò)程中 DNA 聚合酶將 2,6-diaminopurine 看

21、 作堿基 A ，發(fā)生 G 到 A 的轉(zhuǎn)換，測(cè)序就會(huì)發(fā)現(xiàn)堿基 G-A 置換。脫嘌呤現(xiàn)象在富含嘌呤的引物中 發(fā)生的頻率較高。引物合成過(guò)程中，造成堿基缺失，插入，置換突變的因素客觀存在，上述各種原因產(chǎn)生的失 敗序列可通過(guò)純化不同程度地得到去除。但是基于目前大規(guī)模生產(chǎn)的純化方法，還不能達(dá)到 100% 的純度，對(duì) 40 mer 以下的 DNA 制品， HPLC 是最好的純化方法，其次是 ULTRA PAGE 而對(duì) 40 mer 以上的 DNA 制品 ULTRAPAGE 純化要優(yōu)于單純的 HPLC 純化。所以，如您要對(duì) PCR 產(chǎn)物克隆后測(cè)序，一定要選擇 ULTRA PAGE 純化或 HPLC 純化的引物

22、。測(cè)序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)域有突變，特別是 40 個(gè)堿基以下的引物 , 發(fā)生的概率不大，但是偶爾也會(huì) 發(fā)生。 客戶一般可以放心， 引物序列一般都是通過(guò)電腦直接將您的序列復(fù)制到合成儀的， 人為造 成的序列出錯(cuò)可能微乎其微。 在目前的技術(shù)水平下， 各家公司還沒(méi)有辦法徹底解決引物合成出錯(cuò) 的這個(gè)問(wèn)題。 引物合成的固相合成原理都一樣， 采用的機(jī)器也基本相同， 合成主要原料都是由可 數(shù)的幾家跨國(guó)公司提供的， 所以每個(gè)合成服務(wù)商遇到的問(wèn)題也基本類似， 沒(méi)有哪家公司可以完全 避免。Q-3. 長(zhǎng)鏈引物為什么出錯(cuò)的幾率非常高？A-3:引物合成時(shí)，每一步反應(yīng)效率都不能達(dá)到100% ，產(chǎn)生堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀條

23、件都有一直存在。 引物鏈越長(zhǎng)， 出錯(cuò)的頻率累加起來(lái)就越高。 客戶總希望合成的引物完全正 確，這種心情可以理解。但是正像 PCR 擴(kuò)增，不可能絕對(duì)保證擴(kuò)增產(chǎn)物中沒(méi)有突變，引物合成 也不可能保證 100% 正確。通常引物合成中發(fā)生錯(cuò)誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫 聚合酶 PCR 擴(kuò)增過(guò)程所產(chǎn)生的頻率都要高。做引物合成，特別是長(zhǎng)鏈引物合成，出了建議選擇準(zhǔn)備。Q-4. 如何能保證引物的正確性A-4:1. 訂購(gòu)引物時(shí)，選用高純度級(jí)純化方法。2. 最好選用小于 40 個(gè)堿基的引物。3. 克隆實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要選擇 ULTRA PAGE 純化或 HPLC 純化的引物。并且每次克隆都須 進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，以保證序列的正確性， 然后再進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。 進(jìn)行蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)時(shí)， 尤其需要Q-5. PCR 產(chǎn)物經(jīng)克隆后測(cè)序發(fā)現(xiàn)，引物處的堿基有錯(cuò)誤， 怎么辦 ?A-5:1. 遇到這種情況，首先和我們?nèi)〉寐?lián)系，我們的生產(chǎn)人員會(huì)檢查生產(chǎn)的原始記錄，主要是 核對(duì)合成序列是否和定單一致，我們?cè)陔娔X中保留所有原始數(shù)據(jù)。2. 如果確認(rèn)引物合成序列沒(méi)有輸錯(cuò)，我們建議重新挑取克隆測(cè)序，您可能會(huì)找到正確克隆 的。因?yàn)橐锛兌炔豢赡苁?100% ，因此，挑選