如何發(fā)現(xiàn)藥物新靶標(biāo)

1、如何發(fā)現(xiàn)藥物新靶標(biāo)文獻(xiàn)綜述摘要： 藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)是創(chuàng)造新藥物的前提，也是藥物篩選的根底，本文從有 效單體化合物、基因表達(dá)差異、蛋白質(zhì)表達(dá)差異、蛋白質(zhì)相互作用和RNA 干擾方面著手總結(jié)了一些藥物新靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)技術(shù)進(jìn)行了綜述。關(guān)鍵詞： 藥物靶標(biāo)；基因表達(dá)差異；差異蛋白質(zhì)組學(xué)；蛋白質(zhì)相互作用； RNA 干擾引言： 藥物靶標(biāo)是藥物作用而實(shí)現(xiàn)療效的目標(biāo)分子，靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)是藥物創(chuàng)新的 前提，也是藥物篩選的根底。 新靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)對(duì)于更優(yōu)良的創(chuàng)新型藥物的開(kāi)發(fā)具有 重大的促進(jìn)作用。例如，利用 HMG CoA 復(fù)原酶作為藥物靶標(biāo)開(kāi)發(fā)了一系列他汀 類降脂藥物，僅2000年,該類藥物的銷售額達(dá)120億美元，并以每年15%2

2、0%的 速度增長(zhǎng)。Novartis公司利用慢性粒細(xì)胞性白血病(CML相關(guān)蛋白Bcr-Abl為靶標(biāo)， 在短時(shí)間內(nèi)開(kāi)發(fā)出有效治療 CML 的 新藥高活性 Bcr-Abl 激酶抑制劑 STI571(Gleevac)【1】從這些例子可以發(fā)現(xiàn)，生物醫(yī)藥公司花費(fèi)大量的物力和財(cái)力 尋找藥物的新靶標(biāo)。 隨著生命科學(xué)的開(kāi)展， 各種科技的創(chuàng)新， 也出現(xiàn)了很多藥物 靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)技術(shù)。一、從有效單體化合物著手發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo)以療效確定的單體化合物 天然產(chǎn)物或現(xiàn)有藥物 為探針， 然后利用電腦模擬 單體分子與相關(guān)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)及其相互作用， 找到所有的能與其特定結(jié)合的蛋 白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可能與活性藥物單體發(fā)揮作用的機(jī)制相關(guān)，

3、因此是潛在的藥物 靶標(biāo)分子。蔣華良等便是用此方法發(fā)現(xiàn)了 2個(gè)抗幽門螺旋桿菌活性的藥物的作用靶標(biāo)蛋白def和TyX并測(cè)定了 def蛋白復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。張永清 【2】等利用基 因芯片研究苦參堿誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞基因表達(dá)譜改變，發(fā)現(xiàn)CCNBIcycIinD1, PCNA等基因表達(dá)發(fā)生明顯改變，這些基因可能是苦參堿作用靶點(diǎn)之一。Che n【3】 等也利用這個(gè)方法研究阿霉素處理 MCF-7 細(xì)胞后蛋白質(zhì)表達(dá)的改變，發(fā)現(xiàn)阿霉 素造成MCF-7細(xì)胞中熱休克蛋白27(Hsp27)的3個(gè)異形體表達(dá)顯著下降，由此推 測(cè)Hsp27可能是控制乳腺癌生長(zhǎng)的一個(gè)潛在藥物靶標(biāo)。二、以正常組織與病理組織基因表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)

4、靶標(biāo)基因在不同組織和疾病發(fā)生開(kāi)展的不同時(shí)空存在著明顯的基因表達(dá)差異， 表達(dá) 明顯發(fā)生變化的基因常與發(fā)病過(guò)程及藥物作用途徑密切相關(guān)， 這些表達(dá)異常的基 因很有可能是藥物作用的靶點(diǎn)， 可作為潛在的篩選藥物的靶標(biāo) 【4】?；蛐酒夹g(shù)、 mRNA差異顯示技術(shù)、抑制性消減雜交技術(shù)和基因表達(dá)系列性分析技術(shù)等在現(xiàn)代 生命科學(xué)研究中使用也日益廣泛， 這些技術(shù)在新的藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)中同樣扮演了 重要的角色。Heller151等利用基因芯片技術(shù)分析了正常及誘發(fā)病變的巨噬細(xì)胞、 軟骨細(xì)胞系、 原代軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞的 mRNA,發(fā)現(xiàn)了數(shù)種變化明顯的基因，其中包括基質(zhì) 金屬?gòu)椥缘鞍酌富?，為治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提供了新的

5、藥物靶標(biāo)。Kapp16】等利用該技術(shù)分析了霍奇金病細(xì)胞系中 950個(gè)基因的表達(dá)情況，并與EB病毒永生化 的B淋巴細(xì)胞系LCL-GK勺基因表達(dá)譜相比擬，發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素-13及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 通路可能成為治療HD新的藥物靶標(biāo)。Yamamoto7 等通過(guò)基因表達(dá)系列性分析技術(shù)分析 Hela 細(xì)胞中基因的表達(dá)模式， 發(fā)現(xiàn)了許多高表達(dá)的基因， 同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了許多新的腫瘤特異性基因， 這為腫瘤的 治療提供了新的靶標(biāo)。Ryo8】等利用該技術(shù)研究HIV-1病毒感染人T細(xì)胞株MOLT-4 后基因表達(dá)模式變化，發(fā)現(xiàn)了 53 個(gè)發(fā)生顯著表達(dá)變化的基因，這為艾滋病的研 究提供了重要的線索。Fisher91等將mRNA差異顯

6、示技術(shù)用于乳腺癌細(xì)胞與正常乳腺上皮細(xì)胞的比照 研究中，發(fā)現(xiàn)周期蛋白 D2 在癌細(xì)胞中表達(dá)下降，并且進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，結(jié)果暗示了 周期蛋白D2基因可能是5-氮雜胞苷治療乳腺癌的一個(gè)靶基因。 Violette【101等用 該技術(shù)比擬藥物敏感的結(jié)腸癌細(xì)胞系 HT-29與其耐藥的3個(gè)子細(xì)胞系的基因表達(dá)， 發(fā)現(xiàn)ReglV基因在耐藥的腫瘤細(xì)胞系中高度表達(dá)， 而在敏感細(xì)胞系中表達(dá)水平很 低，深入研究RegW基因的功能有可能發(fā)現(xiàn)新的治療結(jié)腸癌的方法。Uekawa"1】等通過(guò)抑制性消減雜交技術(shù)研究與老鼠胚胎成纖維細(xì)胞衰老相關(guān)的 基因，檢測(cè)到TARSH基因在正常肺中高表達(dá)，而在一些肺癌細(xì)胞系中表達(dá)顯著下 降。

7、由此推測(cè)TARSH基因可能能夠抑制腫瘤發(fā)生。劉海燕【12】等人通過(guò)SSH技術(shù) 發(fā)現(xiàn)了許多與腫瘤血管生成相關(guān)的基因， 深入研究這些基因有可能為抗血管形成 治療腫瘤提供了有價(jià)值的靶標(biāo)。三、通過(guò)定量分析和比擬研究在正常和疾病狀態(tài)下蛋白質(zhì)表達(dá)譜的改 變發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)與基因的表達(dá)類似， 同一細(xì)胞在不同的生理和病理環(huán)境中， 其蛋白質(zhì)表達(dá)譜也 會(huì)發(fā)生改變。因此，通過(guò)比照研究正常細(xì)胞和疾病細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化， 來(lái)尋找與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)， 這些相關(guān)蛋白經(jīng)研究篩選后可能成為治療某種疾病 的新靶點(diǎn)。 常用的技術(shù)包括蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、 二維凝膠電泳技術(shù)、 同位素親和標(biāo) 簽技術(shù)、雙向熒光差異凝膠電泳技術(shù)以及它們和質(zhì)譜鑒定

8、的有機(jī)結(jié)合。利用蛋白芯片技術(shù)，Senior【13】等檢測(cè)了來(lái)自于健康人和前列腺癌患者的血清 樣品，在短短的三天內(nèi)發(fā)現(xiàn)了 6 種潛在的治療前列腺癌的藥物靶標(biāo)。 Freedland【14】 等發(fā)現(xiàn)中性肽鏈內(nèi)切酶表達(dá)量的缺失或減少在前列腺癌的早期階段時(shí)常發(fā)生， 暗 示了 CD10可以作為前列腺癌早期治療的新靶標(biāo)。Schumacher【 15】 等應(yīng)用同位素親和標(biāo)簽技術(shù)研究HSP90 抑制劑 GA 處理ALK-(+)ALCL細(xì)胞系后蛋白質(zhì)表達(dá)譜變化，共識(shí)別了 176個(gè)不同表達(dá)的蛋白質(zhì)， 在GA處理的細(xì)胞中49個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)1.5倍，70個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)1.5倍或 更多。馬學(xué)玲 【16】等應(yīng)用雙向熒光

9、差異凝膠電泳技術(shù)比擬大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)6 h病灶側(cè)大腦皮層和正常大鼠相應(yīng)部位蛋白質(zhì)變化， 發(fā)現(xiàn)a-微管蛋白表 達(dá)量在腦缺血組較正常組明顯減少， 因此推測(cè)缺少微管蛋白將導(dǎo)致腦的結(jié)構(gòu)和功 能改變，提示a-微管蛋白有可能成為治療缺血性腦血管病的新靶點(diǎn)。四、以蛋白質(zhì)相互作用為根底發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo)人類許多疾病如癌癥、自身免疫性疾病和病毒性傳染病都是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的錯(cuò)誤或短缺造成的， 因而通過(guò)揭示疾病蛋白與其它蛋白的相互作用 可以發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標(biāo)。 研究蛋白質(zhì)相互作用常用的方法有酵母雙雜交技術(shù)、 噬 菌體展示技術(shù)、外表等離子共振技術(shù)、 串聯(lián)親和純化技術(shù)和雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)。Vasude

10、van 17 等通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)了登革病毒中依賴RNA 的 RNA聚合酶NS5和病毒旋轉(zhuǎn)酶NS3相互作用的區(qū)域，還發(fā)現(xiàn)NS5和新的蛋白質(zhì)細(xì)胞 核轉(zhuǎn)運(yùn)體 importin-beta 之間也發(fā)生相互作用。以它們相互作用的共同區(qū)域作為 藥物作用的靶標(biāo) ,能夠通過(guò)阻止病毒的復(fù)制而治療疾病。黃英【18】等應(yīng)用T7噬菌體展示技術(shù)，以HCV的核心蛋白作為靶分子，對(duì)噬菌 體人肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選。確定了能與 HCV核心蛋白相互作用的蛋白為 SIP1Smad inter-acting-protein這為進(jìn)一步抗HCV感染的預(yù)防和治療提供了新的 靶位。Guermazi【19】等通過(guò)SPR技術(shù)證明，

11、系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者低水平的蛋白SPS,一種抗凝因子是由于自身免疫機(jī)制引起的，揭示了SLE患者血栓形成的機(jī)理。王芹【20】等將SPR和質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合起來(lái)，研究發(fā)現(xiàn) SARS-Co核蛋白與人胚肺二 倍體細(xì)胞2BS和人肺癌細(xì)胞系 A549中的細(xì)胞蛋白 26S蛋白酶調(diào)節(jié)亞單位 S10b簡(jiǎn)稱p42相互作用。繼續(xù)深入研究這種相互作用在SARS-CoV感染及SARS-CoV勺發(fā)生開(kāi)展中發(fā)揮的作用，有可能為治療該疾病提供有價(jià)值的靶標(biāo)。五、應(yīng)用 RNA 干擾技術(shù)特異的抑制細(xì)胞中不同基因的表達(dá)，通過(guò)細(xì) 胞的表型變化發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)Ngo【21】等應(yīng)用RNA干擾文庫(kù)研究活化和生發(fā)中心的彌漫大 B細(xì)胞淋巴瘤，發(fā) 現(xiàn)在活化的B細(xì)

12、胞樣DLBC沖，CARD11是調(diào)節(jié)Ik B激酶活性的上游信號(hào)分子， 這些研究有助于揭示不同于致癌基因的新治療靶標(biāo)。Zhao122】等應(yīng)用RNA干 擾文庫(kù)識(shí)別了 53 個(gè)內(nèi)生的成骨抑制子，這對(duì)于骨疾病的治療具有重要的意義。 值得注意的是RNA干擾技術(shù)并不是完全的靶特異性，有時(shí)也會(huì)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)， 但實(shí)踐證明它在靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。六、總結(jié)通過(guò)上述技術(shù)， 人們可以更加方便的發(fā)現(xiàn)藥物的潛在靶標(biāo)， 靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)無(wú)疑是 對(duì)新藥的研發(fā)起了促進(jìn)作用。參考文獻(xiàn)：1 陳國(guó)強(qiáng)，徐婭禧，郭萌藥物靶標(biāo)和創(chuàng)新藥物：機(jī)遇與挑戰(zhàn)J國(guó)外醫(yī)學(xué)生理、 病理科學(xué)與臨床分冊(cè)， 2004， 24(3):205.2 張永清，黃高

13、升，劉紅娟等 .基因芯片研究苦參堿誘導(dǎo) K562 細(xì)胞基因表達(dá)譜 變化J第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004, 25(6):封 2-01.3 Chen ST,Pan TL, Tsai YC, et al. Proteomics reveals protein profile changes in doxorubicintreatedMCF-7 human breast cancer cellsJ.CancerLett,2002,181(1):95.4 劉二偉，葛長(zhǎng)榮等.生物芯片技術(shù)在中藥新藥開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用前景J中國(guó)獸藥雜 志， 2006， 40(9):45.5 Heller RA, Schena M, C

14、hai A, et al. Discovery and analysis of inflammatory disease-related genes using cDNA microarraysJ.Proc Natl Acad Sci,1997,94(6):2150.6 Kapp U, Yeh WC, Patterson B, et al. Interleukin 13 is secreted by and stimulates the growth of Hodgkin and Reed-Stern-berg cellsJ.J Exp Med,1999,189(12):1939.7 Yama

15、moto M, Wakatsuki T, Hada A, et al. Use of serial analysis of gene expression(SAGE)technologyJ.J Immunol Methods,2001,250(1-2):45.8 Ryo A, Suzuki Y, Ichiyama K, et al. Serial analysis of gene expression in HIV-1-infected T cell linesJ.FEBS Lett,1999,462(1-2):182.9 Fischer H, Chen J, Skoog L, et al.

16、Cyclin D2 expression in familial and sporadic breast cancerJ. Oncol Rep,2002,9(6):1157.10 Violette S, Festor E, Pandrea-Vasile I. Reg IV,A new member of the regenerating gene family, is over expressed in colorectal carcinomasJ. Int JCancer.2003,03(2):185.11 Uekawa N, Terauchi K, Nishikimi A, et al.

17、Expression of TARSHgene in MEFs senescence and its potential implication in human lung cancerJ. Biochem Biophys Res Com-mu n,2005,329(3) 1031.12 劉海燕，胡東，冉宇靚等.抑制消減雜交別離腫瘤血管生成相關(guān)基因J.中國(guó) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào) ,2005,21(1):120.13 Senior K. Fingerprinting disease with protein chip arraysJ.Mol Med Today,1999,5(8):326.14

18、 Freed, Seligson DB, Liu AY, et al. Loss of CD10(neutral endopeotidase)is a frequent and early event in human prostate cancerJ.Prostate,2003,55(1):71.15 Freed, Seligson DB, Liu AY, et al. Proteome-wide changes induced by the Hsp90 inhibitor, geldanamycin in anaplastic large cell lymphoma cellsJ.Prot

19、eomics,2007,7(15):2603.16 馬學(xué)玲， 劉亢丁，江新梅等 .熒光差異雙向凝膠電泳法篩選大鼠腦缺血相關(guān)蛋白J.中國(guó)老年學(xué)雜志，2007,27(11):1025.17 Vasudevan SG, Johansson M, Brooks AJ, et al. Characterization of inter-and intra-molecular interactions of the dengue virus RNA dependent RNA polymerase as potential drug targetsJ.Farmaco,2001,56(1-2):33.18 黃英，蔡雪