抗生素微生物檢定方法學(xué)驗證中的常見問題分析

1、發(fā)布日期 20070423 欄目 化藥藥物評價>>化藥質(zhì)量控制 標(biāo)題 抗生素微生物檢定方法學(xué)驗證中的常見問題分析 作者 審評三部 部門 正文內(nèi)容 審評三部審評五室劉英摘要： 本文對抗生素微生物檢定法中的管碟法在方法學(xué)驗證中的常見問題如線性與范圍中溶液濃度與直徑的關(guān)系、精密度的測定方法等進行了分析，歸納其錯誤的問題，給出了正確的操作方法。關(guān)鍵詞：  抗生素微生物檢定法多組分抗生素方法學(xué)驗證抗生素微生物檢定法是國際上通用的、經(jīng)典的抗生素測定方法。自20世紀(jì)40年代建立至今，在各國藥典中被普遍采用。雖然伴隨著HPLC等化學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展，一些抗生素品種的效價已被化學(xué)分析法所取代

2、，但由于微生物檢定法可直觀、特異地反映出抗生素品種的抗菌活性；多組分抗生素由于結(jié)構(gòu)與不同活性組分生物活性的差異，化學(xué)測定結(jié)果難以準(zhǔn)確表征組分組成、含量和生物活性間的關(guān)系；許多抗生素品種由于各種原因如無特征紫外吸收等，目前沒有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)分析方法表征其活性，故抗生素微生物檢定法目前在各國藥典中仍占有重要的地位，且短期內(nèi)化學(xué)分析法不可能完全取代微生物檢定法。中國藥典2005年版仍采用抗生素微生物檢定法中的管碟法測定其效價，目前申報已有國家標(biāo)準(zhǔn)的該類制劑較多，在質(zhì)量研究中存在諸多問題，現(xiàn)就常見的問題加以分析，希望對注冊申請人有所幫助。一、方法的建立1、 供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的同質(zhì)性 抗生素微生物檢定法的原理

3、以供試品與標(biāo)準(zhǔn)品同質(zhì)為前提，方法建立前，首先應(yīng)確定供試品與標(biāo)準(zhǔn)品是否同質(zhì)，包括化學(xué)結(jié)構(gòu)、所含組分及組分比例的一致性，對于制劑還要考慮輔料的影響是否造成供試品與標(biāo)準(zhǔn)品不同質(zhì)。2、培養(yǎng)基、試驗菌、緩沖液和培養(yǎng)條件的選擇可參照中國藥典建立，在此不再贅述。3、檢定方法的確定 可采用一劑量法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）、二劑量法及三劑量法等。一般確定線性與范圍采用一劑量法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法），常規(guī)含量測定采用二劑量法，標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定采用三劑量法。               &#

4、160;                          4、抗生素溶液的穩(wěn)定性選定的品種可參照中國藥典現(xiàn)行版附錄抗生素微生物檢定法的品種，若溶劑和緩沖液與其不同，應(yīng)考察抗生素儲備溶液和測定溶液在室溫、40和不同pH值緩沖液中，以及放置不同時間的穩(wěn)定性，以確定抗生素儲備溶液和測定溶液的存放時間和條件。    

5、;                                                  

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14、;         二、方法的驗證驗證的目的是證明采用的方法適合于檢測的要求。驗證內(nèi)容有：準(zhǔn)確度、精密度（包括重復(fù)性、中間精密度）、專屬性、適用性和線性。在申報資料中常見的錯誤有：線性測定不符合抗生素微生物檢定法一劑量中心濃度等比測定的原理；精密度的測定方法不正確；無專屬性試驗。下面就方法驗證的內(nèi)容與常見的錯誤加以簡述。1、專屬性 考察雜質(zhì)、輔料等對測定結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，可通過以下試驗驗證：(1) 用輔料等替代抗生素進行試驗，應(yīng)不產(chǎn)生抑菌作用。(2) 采用回收率試驗進行驗證，至少有9對以上數(shù)據(jù)，并進行顯著性檢驗。2

15、、線性 線性系指在設(shè)計的范圍內(nèi)，測試結(jié)果與試樣中被測物濃度直接呈正比關(guān)系的程度。做抗生素微生物檢定法試驗時，被測物濃度應(yīng)轉(zhuǎn)換為對數(shù)濃度。管碟法中抗生素溶液濃度的對數(shù)值與抑菌圈直徑或面積之間的關(guān)系在一定的濃度范圍內(nèi)，應(yīng)呈線性關(guān)系。用一劑量法測定。  、測定方法 (1)確定直線中心點的抗生素濃度。中心點濃度C 0應(yīng)使所致抑菌圈的直徑在1618mm。(2) 線性測定的劑距一般用等比級數(shù)，可選用1:0.80、1:0.85或1:0.88等，稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛认盗小?3)每個濃度為一組，至少設(shè)8組，一般每組35個雙碟，每組雙碟數(shù)m應(yīng)相等。(4)管碟法的線性考察，其直線的最低濃度端與最高濃度端的確定

16、，應(yīng)選擇比所致抑菌圈直徑在1822mm高的濃度為最高濃度，即高濃度應(yīng)涵蓋能致抑菌圈直徑在1822mm的濃度。按中心濃度等比的關(guān)系，求算最低濃度。但最低濃度端應(yīng)涵蓋含量（效價）測定時高、低劑量之比為4：1的低劑量濃度。(5)取制備好底層及菌層培養(yǎng)基的雙碟，每35個雙碟為一組，共分n組(6)各組滴加完畢后，將雙碟在規(guī)定溫度下培養(yǎng)一定時間，測定各抑菌圈直徑。(7)以各組濃度C的對數(shù)值log與相對應(yīng)各濃度的直徑與中心點濃度直徑的差值作線性分析，得回歸方程及相關(guān)系數(shù)r，并對相關(guān)系數(shù)作顯著性檢驗，同時繪制線性圖。、常見錯誤（1）直接以濃度與直徑作線性關(guān)系圖。（2）雖然以抗生素溶液濃度的對數(shù)值與抑菌圈直徑作

17、線性關(guān)系圖，但不是等比系列，如濃度設(shè)計為：1、2、3、4、5、6、7u/ml等。以上兩種現(xiàn)象顯然違背抗生素微生物檢定法的原理，也不可能得出直線關(guān)系。（3）抑菌圈直徑太大或太?。捍笥?4mm或小于14mm均不正常。如：效價測定中高濃度溶液所制的抑菌圈直徑大于26mm時已超出雙碟的直徑范圍而無法測量，低濃度溶液所制的抑菌圈直徑小于14mm時，其濃度的對數(shù)劑量與直徑已不成線性，而在線性研究中結(jié)果為抑菌圈直徑在5mm35mm范圍內(nèi)與濃度的對數(shù)劑量線性關(guān)系良好，顯然上述數(shù)據(jù)是不符合實際情況的。（4）以濃度與效價建立線性關(guān)系。如：劑量濃度（u/ml）0.001    0.01

18、    0.0201    0.0251    0.0402    0.0502    0.1004該方法顯然不符合抗生素微生物檢定方法學(xué)中線性的含義，線性是指滴加抗生素溶液的濃度與所致抑菌圈直徑或面積的關(guān)系，若以濃度與效價建立線性關(guān)系，則是利用已建立好的方法去測定含量的高低，而非對方法本身進行驗證。況且由于高低劑量相差較大，低者僅為1u/ml，高者達50u/ml，也可能不在同一線性范圍。以上幾種結(jié)果均不是從真實試驗得到，也無法進行實際實驗操作。3、準(zhǔn)確度（回收率） 準(zhǔn)確度系指用該方法測定的結(jié)果與真實值接近的程度，通常用回收率（）評價。準(zhǔn)確度驗證，可根據(jù)具體試驗情況選擇如下試驗方法。回收率試驗一般用至少9次測定結(jié)果進行評價，按標(biāo)示量的80、100、120分別投入已知量的被測物，分別測定3次。標(biāo)示量的80、120的回收率可在線性范圍內(nèi)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品的劑量，使其滿足抗生素微生物檢定法的要求。應(yīng)報告己知加入量的回收率或測定結(jié)果平均值與真實值或認(rèn)可參照值之差及其可信限。模擬回收率試驗：按處方成分和比例，分別加入敷料和已知量的被測物，測定回收率。加樣回收率測定：如不能得到制劑的全部組分，可先