丙型肝炎的疫苗研究現(xiàn)狀

1、丙型肝炎的疫苗研究現(xiàn)狀摘要：丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）是引起輸血相關(guān)肝炎及慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要病原，目前尚無有效的治療與預(yù)防手段。本文綜述了當(dāng)前世界HCV疫苗研究的進(jìn)展，并分析了疫苗研制中存在的問題和疫苗研制的策略。關(guān)鍵詞：丙型肝炎病毒；丙型肝炎；疫苗Current advances in hepatitis C virus(HCV) vaccine Abstract: Hepatitis C virus(HCV) accounts for the majority of transfusion acquired hepatitis and may c

2、ause chronic hepatitis, cirrhosis and heaptocellular carcinoma. Currently, there is no effective vaccine against HCV and treatment is expensive and not always effective. In this article, the advances of studies on HCV vaccine were discussed in details. Problems existing in the present and research s

3、trategies used in the future were also analyzed.Key words: hepatitis C virus(HCV); hepatitis C; vaccine 丙型肝炎病毒（HCV）是慢性肝病的主要病原之一，呈世界流行，感染率為1-3，目前全球約有1.7億HCV感染患者。約60的急性丙型肝炎（HC）患者轉(zhuǎn)化為慢性，而慢性患者中分別有8-46和11-19發(fā)展成肝硬化和肝細(xì)胞癌1。當(dāng)前對慢性丙型肝炎患者除干擾素外沒有更特異的有確定療效的治療方法，因此，HCV感染的防治工作更應(yīng)以預(yù)防為主，發(fā)展切實(shí)有效的丙型肝炎疫苗是當(dāng)務(wù)之急。本文綜述了當(dāng)前世界HCV疫

4、苗研究的進(jìn)展，并分析了疫苗研制中存在的問題和疫苗研制的策略。1HCV基因結(jié)構(gòu)與疫苗研制中的問題HCV屬黃病毒科丙型肝炎病毒屬，為單股正鏈RNA病毒，基因組全長9.6 kb，其5端有一個(gè)319-341 nt結(jié)構(gòu)較為保守的非翻譯區(qū)（untranslated region, 5-NTR）。后面為一個(gè)連續(xù)的開放閱讀框架（open reading frame, 0RF），可編碼一個(gè)多聚蛋白前體，此多聚蛋白前體由宿主和病毒的信號肽酶剪接成3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋El（Core、E1、E2）和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）。HCV C蛋白由191個(gè)氨基酸殘基組成，是HCV基

5、因組中較為保守的結(jié)構(gòu)區(qū)域。5UTR區(qū)最為保守，而3UTR對于HCV RNA的正常復(fù)制是不可缺少的（圖1）1。圖1HCV基因結(jié)構(gòu)由于HCV基因序列存在高度變異性，丙肝疫苗的研制面臨很多的挑戰(zhàn)：HCV RNA和病毒蛋白變異性很大，有6種基因型及50多種基因亞型，因而，研制一種可望全球通用的丙肝疫苗十分困難。HCV準(zhǔn)種的存在，是丙肝疫苗研制的又一障礙，即感染人體的HCV為一群不同的HCV株，且在體內(nèi)極易發(fā)生突變，尤其是在HVR1區(qū)，這就使變異的HCV株可能逃避疫苗已建立的保護(hù)性免疫監(jiān)視，這些準(zhǔn)種的性質(zhì)及復(fù)雜性也影響預(yù)防和治療的成功率。深入的系統(tǒng)進(jìn)化分析可將HCV分成至少6個(gè)主要的基因型和至少70個(gè)不

6、同的亞型。其中基因型1、2、3型在我國分布最廣。大多數(shù)HCV感染者都有抗HCV核心蛋白、NS3和NS4的抗體，但是這些抗體的中和作用不明顯，并且感染了HCV后抗-HCV陽性的黑猩猩受到同源或異源HCV株攻擊后，仍可再次發(fā)病。臨床也發(fā)現(xiàn)丙型肝炎可以多次復(fù)發(fā)。缺乏易獲的合適的HCV培養(yǎng)系統(tǒng)及HCV感染動物模型。目前，黑猩猩是HCV感染的唯一動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，但黑猩猩價(jià)格昂貴，數(shù)目少，且屬頻危動物。另外，黑猩猩感染HCV后其轉(zhuǎn)歸也不完全與人類相同。研究發(fā)現(xiàn)，自然感染HCV后痊愈的黑猩猩仍能再次感染同型HCV，提示HCV的自然感染仍不能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫。HCV致病的免疫學(xué)機(jī)制尚未完全澄清，保護(hù)性表位亦未得到

7、確認(rèn)，以上這些都嚴(yán)重限制了HCV疫苗的研發(fā)2。2蛋白疫苗 2.1 肽疫苗 抗原之所以能誘導(dǎo)特異的體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)，是由于它在機(jī)體細(xì)胞中被分解為多肽后與MHC-類或MHC I 類分子結(jié)合，以復(fù)合物的形式激活了Th細(xì)胞，誘生了特異性抗體及CTL3。HCV中的某些T細(xì)胞表位對病毒的清除十分重要，若能得到這些多肽，使其在體內(nèi)或體外直接與MHC I類或MHC-類分子結(jié)合，則所得到的復(fù)合物將能有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答而避免了抗原遞呈的步驟?；谏鲜黾僭O(shè)，人們構(gòu)建了一系列HCV的疫苗多肽，或使之與MHC分子結(jié)合成復(fù)合物，并從中篩選出了一些對研制HCV疫苗具有重要意義的HCV抗原多肽?，F(xiàn)今絕大部分工

8、作都在確定具有免疫原性的肽而不是測試最有希望的肽疫苗。在肽疫苗研究中，一個(gè)經(jīng)典的方法是用HCV感染患者的血清來篩選噬菌體表達(dá)的肽文庫，然后選擇出與患者血清特異反應(yīng)的肽段。用HCV感染的患者血清來篩選在噬菌體文庫中表達(dá)的數(shù)目巨大的HVR 1的所有肽段，可以選擇出既有抗原性又有免疫原性的肽段作為那些HVR 1發(fā)生變異的數(shù)目巨大的變異體的類似物。2.2 包膜蛋白疫苗 HCV包膜ElE2糖蛋白是HCV的表面蛋白，因而最先被用作誘導(dǎo)中和抗體的候選疫苗靶抗原。黑猩猩試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，只有哺乳動物細(xì)胞重組表達(dá)的E2蛋白或者ElE2異二聚體蛋白免疫能抵抗同株HCV攻擊，而用昆蟲細(xì)胞、酵母和大腸桿菌表達(dá)的E2蛋白不起保

9、護(hù)作用。由于HCV高度變異的特點(diǎn)，這種方法顯然還不足以誘導(dǎo)廣泛保護(hù)性的中和抗體。然而選擇合適的免疫佐劑，對慢性HCV感染者接種重組ElE2蛋白也許可通過增強(qiáng)感染者的細(xì)胞免疫應(yīng)答而促進(jìn)病毒清除。Leroux-Roels等4用HCV H 77株E2區(qū)合成肽免疫兔，產(chǎn)生了抗同源性合成肽的高活性抗體。將抗體與等體積含有64個(gè)CID 50的H 77株中和后再分別注射2只黑猩猩。研究表明，H 77株至少有19種不同來源病毒株同時(shí)存在，E2中的HVR 1具有關(guān)鍵的抗體中和表位，從該區(qū)產(chǎn)生的合成肽能激發(fā)中和抗體產(chǎn)生并能保護(hù)黑猩猩對同源性HCV的攻擊，但對HCV基因有變異的突變體沒有中和作用。一些研究顯示，E2

10、中抗HVR 1與中和HCV感染有關(guān)，有人從急性肝炎患者分離的H 77株，用其HVR1區(qū)合成的21個(gè)多肽免疫家兔，用ELISA法證實(shí)該免疫血清能防止H 77株感染HPB Ma細(xì)胞，但不能阻斷對H 77株的突變株H 90株的感染，該結(jié)果表明，抗HVR 1抗體的中和作用具有高度特異性。Sällberg等5用多種E1和E2重組蛋白與人T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞孵育，結(jié)果只有哺乳細(xì)胞表達(dá)的E2重組蛋白能與人T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞結(jié)合，并發(fā)現(xiàn)E2免疫的兔血清能中和E2對靶細(xì)胞的結(jié)合作用，此種抗體叫作中和結(jié)合抗體，對HCV感染有一定的防護(hù)作用。盡管HCV的蛋白類疫苗目前取得了一些進(jìn)展，但是還是處于一個(gè)早期階段。許

11、多策略也證實(shí)對小鼠能誘導(dǎo)出強(qiáng)烈的長時(shí)間的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，對靈長類也取得了一些進(jìn)展。但由于HCV具有多個(gè)基因型及血清型，膜蛋白區(qū)同源性小，加之基因突變率高，容易形成沒有逃逸病毒株，缺乏具有交叉免疫保護(hù)效應(yīng)的中和抗體，這些諸多因素給HCV蛋白類疫苗研究帶來了極大困難。3 核酸疫苗核酸疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因(DNA 或RNA ) 直接導(dǎo)入動物體細(xì)胞內(nèi)，并通過宿主細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。由于HCV結(jié)構(gòu)的變異，與傳統(tǒng)蛋白質(zhì)疫苗相比，DNA疫苗明顯優(yōu)于傳統(tǒng)疫苗。DNA疫苗克服了傳統(tǒng)病毒減毒疫苗、滅活疫苗或多肽疫苗所造成的

12、抗原決定簇的改變，保持了完整的免疫原性；DNA疫苗既可誘導(dǎo)體液免疫又可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，而以后者為主要特征；DNA疫苗可在體內(nèi)長期、穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白，這為研制和開發(fā)利用多基因型與基因突變率高的病毒性疾病疫苗提供了理論依據(jù)。主要有C區(qū)DNA疫苗、E區(qū)DNA疫苗、C+E區(qū)DNA疫苗、Ns區(qū)DNA疫苗等。Zhu等6研究了以HCV E1、E2基困構(gòu)建的重組質(zhì)粒免疫BALBc小鼠的免疫效果。結(jié)果表明：3次免疫后，所有小鼠均出現(xiàn)了抗El、E2抗體，抗E1抗體滴度最高達(dá)l：320，而抗F2抗體滴度最高達(dá)1：1280。淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)未見有針對E1的特異性增殖，而針對E2的增殖刺激指數(shù)平均為1.4，且免疫后的小鼠

13、IFN-1的分泌也顯著高于對照組。Lagging等7構(gòu)建了C基因（第1-191aa）重組質(zhì)粒pcDNA HCV Core，0.2 mg質(zhì)粒肌肉注射免疫BALBc小鼠2-3次后，于第6 wk處死小鼠，可檢測到較高水平的抗C抗體，免疫2次或3次的抗體滴度相似。這些結(jié)果提示HCV C區(qū)將有助于HCV疫苗的研制。以上實(shí)驗(yàn)說明，HCV C區(qū)構(gòu)建的重組質(zhì)粒均能在真核細(xì)胞中表達(dá)，且能誘導(dǎo)出特異性體液免疫和細(xì)胞免疫，加上C區(qū)相對保守，是研制HCV DNA疫苗的主要靶抗原之一。Rollier等8以HCV Ia基因型E2區(qū)不同基因片段構(gòu)建了3種不同重組體，用im或im加iE等不同途徑免疫小鼠，抗體陽性率在60-1

14、00之間?？梢奌CV DNA免疫，im加iE是最有效的方法。Ara等9將編碼結(jié)構(gòu)區(qū)（C+E1+E2）基因片段（341-2449nt）克隆入含CMV啟動子的PRC載體中，構(gòu)建HCV結(jié)構(gòu)區(qū)DNA疫苗，通過哺乳細(xì)胞體外表達(dá)和免疫小鼠研究證實(shí)，其不僅能在Human293、BALBc、cosl中表達(dá)C、E1、E2蛋白，而且還能誘導(dǎo)BALBc小鼠產(chǎn)生抗體和特異性CTL的活性。另有人用HCV C+E2序列構(gòu)建的質(zhì)粒DNA疫苗免疫小鼠能誘導(dǎo)特異性的CTL活性、抗C和抗E2抗體應(yīng)答，和Thl為主的增生有關(guān)。Lang等 10一證實(shí)在HCV NS3區(qū)存在一個(gè)CTL表位，其最小單位由10肽組成，推測其可作為HCV D

15、NA疫苗構(gòu)建的有效。與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)疫苗相比，DNA疫苗有可激發(fā)機(jī)體全面的免疫應(yīng)答、可表達(dá)接近天然構(gòu)象的抗原，抗原性強(qiáng)以及能聯(lián)合免疫等優(yōu)點(diǎn)。但同時(shí)，DNA疫苗仍有許多實(shí)際問題阻礙其發(fā)展。主要體現(xiàn)在：（1）HCV屬RNA病毒，具有高度的變異性；（2）只對人及黑猩猩易感；（3）難以體外培養(yǎng)；（4）缺乏有效的體外復(fù)制系統(tǒng)等問題，仍需進(jìn)一步研究。結(jié)語綜上所述，對HCV疫苗的研究尚存在許多困難，但隨著對HCV免疫機(jī)制的進(jìn)一步了解，通過對體外復(fù)制模型的進(jìn)一步完善及增強(qiáng)免疫效果的研究，相信在不遠(yuǎn)的將來，HCV疫苗的研制一定會有突破。參考文獻(xiàn)1. Ciesek S, Steinmann E, Wedemeyer

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