煙草NtLS基因RNA干擾表達載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

1、2011-08, 32 (4)中國煙草科學(xué) Chinese Tobacco Science31煙草NtLS基因RNA干擾表達載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化王衛(wèi)鋒，太帥帥，王 魯，劉貫山，李鳳霞，高曉明，孫玉合*（農(nóng)業(yè)部煙草類作物質(zhì)量控制重點開放實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島266101）摘 要：腋芽的形成涉及多個調(diào)控基因，其中關(guān)鍵基因編碼的蛋白屬于植物特有的GRAS蛋白家族，它的突變或功能缺失將影響腋生分生組織的形成。筆者利用RACE技術(shù)克隆了煙草 NtLS基因（GenBank登錄號EU935581），NtLS與調(diào)控植物腋生分生組織形成的基因 LS/LAS/MOC1序列高度相似。本研究從該基因上

2、選取干擾片段，構(gòu)建了含有反向重復(fù)序列的RNAi干擾表達載體，并通過農(nóng)桿菌侵染的方法轉(zhuǎn)染煙草W38，以期為NtLS基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：煙草；NtLS; RNA干擾中圖分類號：TS413文章編號：1007-5119（2011）04-0031-05 DOI : 10.3969/j.issn.1007-5119.2011.04.008Construction of RNAi Vector ofNtLS Gene and its Transformation in TobaccoWANG Weife ng, TAI Shuaishuai, WANG Lu, LIU Gua nsha n, L

3、I Fe ngxia, GAO Xiaomi ng, SUN Yuhe(Key Laboratory of Tobacco Quality Control, Ministry of Agriculture, Tobacco Research Institute, Chinese Academy of AgriculturalSciences, Qingdao 266101, China)Abstract: Axillary bud formation involves many regulatory genes, one of key factors belongs to the plant

4、specific protein family GRAS. Mutation or function missing of these genes would affect the axillary formation. The tobacco NtLS gene (EU935581) was cloned by RACE technology in our lab. The sequences of NtLS are highly similar to those of LS/LAS/MOC1, which regulate the formation of axillary meriste

5、ms. The interference fragments were chosen fromNtLS and the RNAi expression vectors wereconstructed and transformed into Nicotiana tabacum W38 by agrobacterium-mediated leaf disc transformation methods, to form basis for further study of NtLS function.Keywords: tobacco; NtLS; RNAi 1 *4-2012 Chirui A

6、cademic Journal Ekctronic PuKlijihing House. All rights reserved, http:/wavi. Jidt2011-08, 32 (4)中國煙草科學(xué) Chinese Tobacco Science#煙葉生產(chǎn)中，打頂之后煙株上的腋芽會迅速發(fā) 生。腋芽的生長會消耗大量養(yǎng)分，如不及時去除， 將導(dǎo)致煙葉產(chǎn)量減少，品質(zhì)下降。目前去除腋芽主要靠人工抹杈和使用抑芽劑。人工抹杈不但費工 費時，而且抹杈造成的傷口利于一些病原菌的入 侵，容易造成病害傳播2。而抑芽劑多為有機合成， 存在著影響煙葉品質(zhì)、毒性殘留以及環(huán)境污染等冋 題，而且使用成本較高。從腋芽形

7、成的分子機理入 手，利用分子育種手段可能是解決煙草腋芽問題的 一條有效途徑。腋芽的形成由胚后發(fā)育形成的腋生分生組織 決定，在腋生分生組織形成過程中涉及多個調(diào)控基 因，女口 LS、LAS、MOC1等，這類基因編碼的 基金項目：國家煙草專賣局重點資助項目（110200701021）蛋白屬于植物特有的 GRAS蛋白家族，它們的突變 或功能缺失將影響腋生分生組織的形成。本研究利 用RACE技術(shù)克隆了煙草 NtLS基因（Gen Ba nk登 錄號EU935581 ），該基因的全長 cDNA序列為1 847 bp，編碼區(qū)為1 224 bp，編碼407個氨基酸，基因 序列不含有內(nèi)含子。NtLS與調(diào)控植物腋生

8、分生組 織形成的基因 LS/LAS/MOC1序列高度相似。為了 明確NtLS的功能，經(jīng)過序列比對分析，我們從該 基因上選取干擾片段，構(gòu)建了含有反向重復(fù)序列的 RNAi干擾表達載體pART27-FR，并通過農(nóng)桿菌侵 染的方法轉(zhuǎn)化煙草品種W38，獲得了轉(zhuǎn)化煙草幼苗，為從分子手段研究煙草腋芽形成與控制奠定了 基礎(chǔ)。 1 *4-2012 Chirui Academic Journal Ekctronic PuKlijihing House. All rights reserved, http:/wavi. Jidt2011-08, 32 (4)中國煙草科學(xué) Chinese Tobacco Scienc

9、e32作者簡介：王衛(wèi)鋒，男，碩士，研究方向為煙草分子育種。E-mail: sdwangweifeng。*通信作者，E-mail: yhsun收稿日期：2010-06-21 1 *4-2012 Chirui Academic Journal Ekctronic PuKlijihing House. All rights reserved, http:/wavi. Jidt34中國煙草科學(xué)2011年第32卷1材料與方法1.1 材料用于載體構(gòu)建的基本質(zhì)粒pKANNIBAL 和PART27 由 Peter M. Water-house 實驗室惠贈。煙草 品種W38及根癌農(nóng)桿菌菌株 EHA105為本實驗

10、室 保存。大腸桿菌感受態(tài)菌株（DH5 a）、植物基因組DNA提取試劑盒購自天根生化有限公司，Taq酶、限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA片段純 化試劑盒以及瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自大連寶 生物生物工程有限公司， T4 DNA連接酶購自NEB 公司，小牛小腸堿性磷酸酶（ CIAP ）購自MBI公 司，其他試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。1.2方法1.2.1干擾片斷的選擇及引物設(shè)計選取NtLS基因上的非保守區(qū)段 7081 041 bp間長334 bp的序列 作為干擾片段。根據(jù)干擾片段的堿基順序以及 pKANNIBAL 上intron兩端的限制性內(nèi)切酶位點， 分別設(shè)計正、反向插入片段的擴增引物。正向片段 引

11、物 F1 ： ata ctc gag CGA TCC ACA TCG TTG ATT TTG（引入 XhoI 酶切位點）,F2 : ata ggt acc ATC CTT AAC TTT TCG CGG TCT T （引入 Kpnl 酶切位點）, 預(yù)期擴增片段為352 bp;反向片段引物 R1 : ata tct aga CGA TCC ACA TCG TTG ATT TTG （引入 XbaI 酶切位點）,R2: ata aag ctt ATC CTT AAC TTT TCG CGG TCT T （引入Hindlll酶切位點），預(yù)期擴增片 段為352 bp。1.2.2正、反向片段擴增及中間載體

12、構(gòu)建以煙草W38基因組DNA為模板，分別利用正、反向片段 引物進行擴增。PCR反應(yīng)程序為：94 C變性30 s, 57C復(fù)性30 S, 72 C延伸45 s, 30個循環(huán)后72C延 伸7 min PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，分別利用XhoI/Kpnl、 XbaI/Hindlll兩對限制性內(nèi)切酶和 T4連接酶，將正、 反向片段插入pKANNIBAL上的多克隆位點，構(gòu) 建中間載體 pKANNIBAL-FR ，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸 桿菌感受態(tài)細胞（DH5 a）,在含有 Kan （50 mg/L） 的LB培養(yǎng)基上進行篩選，挑取單菌落經(jīng)擴大培養(yǎng) 后提取質(zhì)粒，進行Xhol/Xbal雙酶切鑒定。1.2.3 RNA 干擾

13、表達載體的構(gòu)建用Notl分別酶切中間載體 pKANNIBAL-FR 和表達載體 pART27 , 電泳回收 RNAi表達序列和酶切后的 pART27。T4 連接酶連接RNAi表達序列與CIAP處理酶切后的 pART27 ,連接后的轉(zhuǎn)化、篩選、及酶切鑒定同1.2.2 , 并送大連寶生物生物工程有限公司進行測序，測序 上游引物為：CTA TCC TTC GCA AGA CCC T ，測 序下游引物為：TAG GCG TCT CGC ATA TCT C , 將構(gòu)建正確的RNAi干擾表達載體命名為 pART27-FR。1.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化體篩選采用凍融8法將pART27-FR導(dǎo)入農(nóng)桿菌 E

14、HA105，葉盤法 轉(zhuǎn)化煙草W38。轉(zhuǎn)化體篩選的 MS培養(yǎng)基中含有 Kan （100 mg/L）和 Carb （300 mg/L）。1.2.5轉(zhuǎn)化煙草幼苗的 PCR檢測以轉(zhuǎn)化煙草幼 苗的基因組總DNA為模板，根據(jù)RNAi表達序列 上35S啟動子、正（反）向特異片段以及終止子的 序列，分別設(shè)計針對轉(zhuǎn)化煙草幼苗的正（反）向插 入片段的檢測引物。正向插入片段檢測引物PF-1：CCA CTA TCC TTC GCA AGA CC , PF-2: CGG TCT TTC AAG AGC CTG TG，擴增片段大小為 388 bp。 反向插入片段檢測引物 RT-1: TTA CAG TTG GGA AAT

15、 TGG GTT CG , RT-2: CAT AGG CGT CTC GCA TAT CTC ,擴增片段大小為 411 bp。擴增片段 回收、純化后，進行測序。2 結(jié)果2.1正、反向片段的 PCR擴增以W38基因組DNA為模板，分別用攜帶有酶 切位點的正、反向引物進行PCR擴增，電泳檢測擴 增產(chǎn)物，擴增片段大小與預(yù)期一致。將目的條帶回 收進行酶切反應(yīng)。2.2 中間載體pKANNIBAL-FR 的酶切鑒定純化后的正反向片段分別利用Xhol/Kpnl、Xbal/HindHI兩對限制性內(nèi)切酶和 T4連接酶，對應(yīng) 插入在pKANNIBAL 多克隆位點上，經(jīng) Xhol/Xbal 雙酶切鑒定，酶切片段大

16、小與預(yù)期大小一致，說明 1 *94-2012 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights 第4期王衛(wèi)鋒等：煙草NtLS基因RNA干擾表達載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化35已成功構(gòu)建了中間載體pKANNIBAL-FR ，形成在PPDK）內(nèi)含子序列兩邊分別含有正、反向NtLS基因丙酮酸磷酸雙激酶（pyruvate orthophosphate dikinase,特異片段的RNAi表達盒（圖1 ）。 1 *4-2012 China Academic Jaumal Electronic Publijihin

17、g House. Al rights reserved, http:Anki.iidt第4期王衛(wèi)鋒等：煙草NtLS基因RNA干擾表達載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化# 1 *4-2012 China Academic Jaumal Electronic Publijihing House. Al rights reserved, http:Anki.iidt第4期王衛(wèi)鋒等：煙草NtLS基因RNA干擾表達載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化#CaMV35S啟動子NotI XhoIPPDK內(nèi)含子OCS終止子forward fragme ntreverse fragme nt日川冷川險圖1 NtLs - RNAi表達盒示意圖F

18、ig. 1 Expression box of NtLS-RNAi注: forward fragment:正向插入的s基因的352 bp片段；reverse fragment:反向插入的 基因的352 bp片段 1 *4-2012 China Academic Jaumal Electronic Publijihing House. Al rights reserved, http:Anki.iidt第4期王衛(wèi)鋒等：煙草NtLS基因RNA干擾表達載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化# 1 *4-2012 China Academic Jaumal Electronic Publijihing House. A

19、l rights reserved, http:Anki.iidt第4期王衛(wèi)鋒等：煙草NtLS基因RNA干擾表達載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化362.3 RNA干擾表達載體pART27-FR的測序鑒定將構(gòu)建的干擾表達載體送大連寶生物生物工 程有限公司進行測序，測序結(jié)果表明已成功構(gòu)建了RNAi干擾表達載體 pART27-FR （圖2 ）。2.4轉(zhuǎn)化煙草幼苗的 PCR檢測以轉(zhuǎn)化煙草幼苗的基因組總DNA為模板，以正向插入片段檢測引物 PF-1和PF-2進行PCR擴 增；以反向插入片段檢測引物 RT-1和RT-2進行PCR 擴增。電泳檢測PCR擴增結(jié)果表明，RNAi干擾表 達載體pART27-FR已成功轉(zhuǎn)入煙草

20、 W38中（圖3）。 3討論RNA干擾（RNAi ）在許多生物中普遍存在， 在真核生物中RNAi的功能主要表現(xiàn)在抵抗病毒復(fù) 制表達、抑制轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座以及調(diào)控基因表達等方 面，利用RNAi技術(shù)對于研究植物基因功能和轉(zhuǎn)基 因植物具有積極的意義。目前，植物RNAi介導(dǎo)的方法主要包括正義 RNA介導(dǎo)的共抑制、反義 RNA 介導(dǎo)的基因抑制、病毒介導(dǎo)的基因沉默（virusinduced gene silencing , VIGS ） 和 hpRNA 介導(dǎo)的基9因沉默。其中，VIGS法采用幼苗或植株局部接種 的方式，不能穩(wěn)定遺傳，因而無法對萌發(fā)期和幼苗10期表達的基因功能進行研究。正義RNA介導(dǎo)的共抑制和反義

21、RNA介導(dǎo)的基因抑制的基因沉默效 率為0%30% ,而hpRNA介導(dǎo)的基因沉默效率可 達到48%100%7。hpRNA介導(dǎo)的基因沉默已成 為RNAi研究的熱點，它具有有效率高、干擾作用 持久、可穩(wěn)定遺傳給子代、應(yīng)用范圍廣泛等優(yōu)點11。 RNAi干擾載體構(gòu)建過程中，干擾片段的長度和在 靶基因中的位置將影響 RNAi的效率和效果9。因此，干擾片段的選擇是RNA干擾實驗中的一個重要環(huán)節(jié)。一般情況下，選擇的干擾片段長度應(yīng)在 90900 bp之間，選擇的區(qū)段可以在基因的內(nèi)部編 碼區(qū)，也可以在3 或5 端的非編碼區(qū)， 對于300 bp以上的干擾片段，基本可以保證被加工后所得的 前體中包含能夠有效進行 RN

22、A干擾的dsRNA。此 外，為了避免非特異性RNA干擾的發(fā)生，在選擇干擾片段時，對于基因的保守區(qū)域應(yīng)該謹慎對待。 在對煙草幼苗的檢測過程中，也分別根據(jù)啟動子和 終止子序列設(shè)計了 PCR擴增引物，試圖對包括正向 插入片段、內(nèi)含子以及反向插入片段的區(qū)域進行擴 增。但是，這樣的嘗試都沒有成功，這很可能是由 于該片段序列特殊，能夠自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使引 物不能與模板結(jié)合，導(dǎo)致 PCR反應(yīng)無法繼續(xù)進行。 植物中存在著多條調(diào)控腋生分生組織形成的途徑， 對擬南芥的研究表明，LAS和RAX是兩條相對獨立 的調(diào)控途徑，LAS在REV的上游起作用，而 RAX 在CUC2的上游起作用，REV和CUC2又進一步對 分

23、生組織標記基因（STM）進行調(diào)控，LAS和RAX 在功能上可能存在一定的互補4,12。由于植物中存在著多條調(diào)控腋生分生組織形成的途徑，NtLS基因被RNA干擾后，腋生分生組織的形成可能會從其 他途徑得到補償，本研究中，對于轉(zhuǎn)基因陽性煙草 的鑒定是在DNA水平的PCR檢測，轉(zhuǎn)基因陽性植 株中NtLS基因在時空表達上的差異，還需進一步 在RNA和蛋白質(zhì)水平上進行研究，并結(jié)合植株形 態(tài)觀察，以確定 NtLS基因的表達抑制效果及腋芽 發(fā)生的變化。 1 *4-2012 China Academic Jaumal Electronic Publijihing House. Al rights reserv

24、ed, http:Anki.iidt第4期王衛(wèi)鋒等：煙草NtLS基因RNA干擾表達載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化# 1 *4-2012 China Academic Jaumal Electronic Publijihing House. Al rights reserved, http:Anki.iidt37中國煙草科學(xué)2011年第32卷 1 *4-2012 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved,ki.iidt38中國煙草科學(xué)2011年第32卷XbjlkdnKpmXhdlF

25、midisdliignHi35s promolrXhol+ KpnlDigestionLigationintronKpnl4F-inorl 1pKANINIBAL*F6418 b pXh&l35s promoterHindIII+ XbaIDigestionLigationR-lnwrtHindlllintro hpKANNlBAL-FR6777 bpiKpnlj Finert35s promotes 忖計NotI DigestionarWEft2弓川oncokE!Ligation圖2 RNA 干擾表達載體 pART27-FR的構(gòu)建Fig.2 Construction of pART27-FR

26、 expression vector 1 *4-2012 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved,ki.iidt第4期王衛(wèi)鋒等：煙草NtLS基因RNA干擾表達載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化391 2 3 4 5 6 7 M388 bp411 bp圖3轉(zhuǎn)化煙草幼苗的檢測Fig.3 Electrophoresis testing of PCR amplification afterseedling transformation注：1: W38 , 26 :轉(zhuǎn)化煙草幼苗，7: pAR

27、T27-FR , M :DNA分子量標準 Marker I (北京全式金公司)參考文獻1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所.中國煙草栽培學(xué)M.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)岀版社，2005.2 陳德鑫，王鳳龍，楊清林，等.煙草抑芽劑及其使用方 法J.煙草科技，2003 (6): 46-48.3 Schumacher K, Schmitt T, Rossberg M, et al. The Lateral suppressor (Ls) gene of tomato encodes a new member of the VHIID protein familyJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96: 290-295.4 Greb T, Clarenz O, Schafer E, et al. Molecular analysis ofthe LATERAL SUPPRESSOR gene in Arabidopsis reveals a conserved control mechanism for axillary meristem formation J. Genes Dev, 2003, 17: 1175-1187.5 Li X, Qian Q, Fu Z, et al. Control of tillering in riceJ.Nature,