分子生物學實驗指導

1、實驗1 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備【實驗目的】掌握制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的方法?！緦嶒炘怼矿w外連接的重組DNA分子導入合適的宿主細胞中才能大量的進行復制、增殖和表達。細菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)叫感受態(tài)。CaCl2法是目前實驗室常用的制備感受態(tài)細胞的方法，其原理是使細菌處于0、CaCl2低滲溶液中，細胞膨脹成球形，細胞膜的通透性發(fā)生改變，外源DNA附著于細胞膜表面，經42短時間熱沖擊處理，促進細胞吸收DNA復合物。本實驗以JM109菌珠為受體細胞，用CaCl2處理受體菌使其處于感受態(tài)。轉化是指質粒DNA或以它為載體構建的重組子導入細菌的過程。利用pBS-T質粒轉化制備的感受態(tài)菌，可用于所制

2、備感受態(tài)菌的轉化鑒定。pBS-T質粒攜帶有氨芐青霉素，可使接受了該質粒的受體菌具有了氨芐青霉素抗性，將經過轉化后的受體細胞經過適當稀釋，在含氨芐青霉素的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有轉化子才能存活，而未受轉化的受體細胞則因無抵抗氨芐青霉素的能力而死亡?！緦嶒瀮热菖c方法】1感受態(tài)細胞的制備（1）從新活化的JM109菌平板上挑取單菌落，接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中（不含Amp），37振蕩培養(yǎng)12h左右，至對數(shù)生長期，將該菌液以1:1001:50轉接于100ml LB培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)23h（OD600約0.20.4）。（2）將菌液冰浴10min后，轉入離心管中，于4離心4000rpm，10min，去

3、上清，收集菌體。 （3）. 用10ml冰預冷的0.1mol/L CaCl2懸浮細胞，冰浴1530min。（4）04，離心4000rpm，10min。（5）棄上清液，每50ml初始培養(yǎng)物加入2ml冰預冷的0.1mol/L CaCl2溶液，小心懸浮細胞，冰上放置30min。（6）制備好的感受態(tài)細胞懸浮液可在冰上放置24h內直接用于轉化實驗，也可加入1/10高壓滅菌甘油, 置-70凍存。2感受態(tài)(JM109)轉化鑒定(無菌操作) 1 取感受態(tài)細菌100l，加入pUC18（或pBR322）質粒(0.3mg/ml)10ul混勻。2 冰浴30min后,42水浴熱休克2min，再于冰浴2min,加入LB液體

4、培養(yǎng)基0.5ml, 37振蕩培養(yǎng)40min。3分別取菌液30100ul加到含Amp的LB固體培養(yǎng)基平皿上， 用三角玻璃刮刀鋪板室溫放置2min，然后倒置放入37恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜,觀察是否有菌落。4結果分析：在培養(yǎng)基平板上應可以觀察到轉化子形成的菌落?！緦嶒灉蕚洹?LB培養(yǎng)基 取胰蛋白胨2g, 酵母提取物1g, 氯化鈉2g, 加水160mL溶解后用1mol/L氫氧化鈉調pH至7.0, 定容至200mL，高壓滅菌。2固體培養(yǎng)基 取胰蛋白胨2g, 酵母提取物1g, 氯化鈉2g, 瓊脂粉1.2g, 加水160mL溶解后用1mol/L氫氧化鈉調pH至7.0, 定容至200mL，高壓滅菌。臨用前將固體培

5、養(yǎng)基融化后倒入平皿中, 待凝固后備用。30.1mol/L CaCl2 取CaCl2 1.11克加雙蒸水定溶至100mL，然后用0.22m微孔濾膜過濾除菌?！咀⒁馐马棥?. 實驗中所用的器皿均要滅菌，以防止雜菌和外源DNA的污染。2. 實驗過程中要注意無菌操作，溶液移取、分裝等均應在無菌超凈工作臺上進行。3. 應收獲對數(shù)生長期的細胞用于制備感受態(tài)，OD600不應高于0.6。4. 制備感受態(tài)細胞所用試劑如CaCl2等的質量要好。 5. 整個實驗一定要在冰浴條件下操作，溫度時高時低會影響轉化效率。642熱處理很關鍵，溫度要準確，轉移速度要快?！舅伎碱}】1 何謂感受態(tài)細胞？2制備感受態(tài)細胞時需注意什么

6、？實驗2 DNA的轉化及陽性克隆的篩選【實驗目的】學習DNA體外重組技術及轉化方法了解藍白斑實驗篩選轉化子的原理和方法?！緦嶒炘怼客庠碊NA與載體分子的連接就是DNA重組，這種重新組合的DNA叫做重組子。DNA在體外的連接重組是基因工程操作的核心技術之一，其本質是一個酶促反應過程。即在一定的條件下，DNA連接酶催化兩個雙鏈DNA片段的5端磷酸和3端羥基之間相互作用，形成磷酸二酯鍵的過程。常用的DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。其中T4噬菌體DNA連接酶對底物的要求低，能更有效地連接DNA的平末端，應用更廣泛。T4噬菌體DNA連接酶需要鎂離子和ATP作為輔助因子

7、，在一定的溫度和pH條件下進行連接反應。體外連接的重組DNA分子必須導入合適的宿主細胞中才能大量的進行復制、增殖和表達。本實驗利用pUC18作為載體，經T4 DNA連接酶作用，將外源基因插入其多克隆位點，構建重組質粒，轉化到大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞中，利用藍白斑實驗篩選出轉化子?！緦嶒瀮热菖c方法】(1) 將凍存的感受態(tài)細胞置于冰上，緩慢解凍；(2) 加入待轉化的質粒DNA，輕輕混勻，冰浴30 min；(3) 42 熱激90 s；(4) 立即置冰上5 min；(5) 加入無抗性的800 l LB液體培養(yǎng)基，37 緩慢震蕩活化1 h到1.5h；(6) 活化好的菌體室溫5 000 r/min，5

8、 min離心；(7) 棄上清，用200 l沒有抗性的LB液體培養(yǎng)基吹打懸浮菌體，藍白篩選時，向懸浮的菌液中加入16 l 50 mg/mL IPTG和40 l 20 mg/mL X-gal；然后將全部液體涂布于含有相應抗生素的LB固體培養(yǎng)基上；超凈工作臺上，將培養(yǎng)皿口半開，等培養(yǎng)基表面的液體完全蒸發(fā)后再完全蓋好培養(yǎng)皿；(8) 37 倒置培養(yǎng)至菌體適當大小時，大約12-16 h，再進行下一步實驗?！緦嶒灉蕚洹?載體DNA，外源DNA2T4 DNA連接酶310T4 DNA連接酶緩沖液4感受態(tài)細菌5LB液體培養(yǎng)基6LB固體培養(yǎng)基平皿（含amp）7X-gal8IPTG【注意事項】1根據(jù)具體情況調節(jié)酶的用

9、量。平端連接效率比粘端連接低得多，因而應加大酶的用量。2正確調整載體DNA和外源DNA之間的比例有助于獲得高產量的重組產物。一般外源DNA的摩爾數(shù)應控制在載體DNA摩爾數(shù)的310倍。實驗3 DNA的限制性酶切反應【實驗目的】掌握DNA限制性內切酶酶切的基本原理?！緦嶒炘怼肯拗菩詢惹忻改芴禺惖刈R別、結合于一段被稱為限制性酶序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上,并切割雙鏈DNA。它可分為三類，其中類限制性內切酶在分子克隆中得到了廣泛應用，它們是重組DNA技術的基本工具酶。絕大多數(shù)類限制酶可識別長度為4至6個核苷酸的回文序列，其切割位點在識別序列中, 有的在對稱軸處切割雙鏈DNA, 產生平末端

10、的DNA片段; 有的切割位點在對稱軸一側, 產生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端。 【實驗內容與方法】1）以鑒定為目的的酶切在無菌的1.5 mL Eppendorf 管中加入：10 buffer 1 l質粒DNA 1 l限制性內切酶 0.2 l（10 U/l）加入dd H2O至總體積 10 l37 溫育2-4 h，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結果，注意：質粒是以1.5 mL菌液所提質粒用10 l ddH2O溶解所得的。2）以回收酶切產物為目的的酶切在無菌的1.5 mL Eppendorf管中加入：10 buffer 5 l質粒DNA 3-10 l限制性內切酶 1-2 l（10 U/l）加入

11、ddH2O至總體積 50 l37 溫育過夜，通過瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段?！緦嶒灉蕚洹?pBS-T質粒2Hind 酶及其酶切緩沖液3EcoR I 酶及其酶切緩沖液【注意事項】(1) 限制性內切酶需保存于-20，操作時應將酶保持在冰浴中，避免長時間置于高溫中。(2) 在酶切反應中，應最后加入酶，盡量減少室溫接觸機會。(3) 加樣時吸頭垂直進入試劑管，避免碰到管壁，加酶時吸頭深入不可過深。每加完一樣要換一個吸頭，同時在已加的樣品前做個記號以防止錯加或漏加，避免污染。(4) 注意酶的用量，加入的酶量按1-3U/ug DNA計算，酶的體積應低于反應總體積的10%，以避免酶液中甘油干擾反應。酶量過大時

12、，有產生星號活性的可能，即在識別序列以外的位點進行切割。(5)酶解消化反應溫度及時間根據(jù)該酶使用說明書而定。【思考題】1酶切時應注意什么？2. 如果一個DNA酶解液在電泳后發(fā)現(xiàn)DNA未被切動,可能是什么原因？藍白篩選的原理實驗材料介紹1）載體質粒和轉化受體菌株：實驗所使用的載體質粒DNA為pBS,轉化受體菌為E. coli DH5菌株。E. coli DH5菌株帶有-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。載體質粒DNA pBS上帶有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調控序列和-半乳糖苷酶N端146個氨基酸的編碼序列。(這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點,但并沒有破壞lacZ的閱讀框架,不影響其正常功能。

13、)在各自獨立的情況下,pBS和DH5編碼的-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在pBS和DH5融為一體時可形成具有酶活性的蛋白質。這種lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的-半乳糖苷酸陰性突變體之間實現(xiàn)互補的現(xiàn)象叫-互補。2）實驗用顯色方法實驗中使用X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)和IPTG(異丙基硫代-D-半乳糖苷)而非直接使用-半乳糖。X-gal 以及 -半乳糖 均為 -半乳糖苷酶底物，但是X-gal不能誘導-半乳糖苷酶操縱子。實驗中使用IPTG以誘導-半乳糖苷酶操縱子。X-gal在-半乳糖苷酶作用下生成深藍色產物。 實驗原理1）初步篩選載體質

14、粒DNA pBS上帶有Ampr 基因而外源片段上不帶該基因,故轉化受體菌后只有帶有pBS DNA的轉化子才能在含有Amp的LB平板上存活下來;而只帶有自身環(huán)化的外源片段的轉化子則不能存活。此為初步的抗性篩選。2）藍白篩選 當外源片段插入到pBS質粒的多克隆位點上后會導致讀碼框架改變, 表達蛋白失活, 產生的氨基酸片段失去-互補能力, 含重組質粒的轉化子在生色誘導培養(yǎng)基上只能形成白色菌落。而沒有重組質粒的轉化子產生-互補，在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(異丙基硫代-D-半乳糖苷)誘導形成藍色菌落。 實驗干擾在實際操作中,藍白篩選出現(xiàn)是淺藍色重組子的

15、原因是：插入小片段時，質粒仍可以表達有缺陷N-末端a肽與B連互補形成活力有缺陷的半乳糖苷酶 重組子形成淺藍斑。即而出現(xiàn)假陰性。實驗4 植物基因組DNA的提取一、實驗目的掌握植物總DNA的抽提方法和基本原理。學習根據(jù)不同的植物和實驗要求設計和改良植物總DNA抽提方法。二、實驗原理通常采用機械研磨的方法破碎植物的組織和細胞，由于植物細胞勻漿含有多種酶類(尤其是氧化酶類)對DNA的抽提產生不利的影響，在抽提緩沖液中需加入抗氧化劑或強還原劑(如巰基乙醇)以降低這些酶類的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并減少研磨過程中各種酶類的作用。十二烷基肌酸鈉(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化銨(hexad

16、yltrimethyl ammomum bromide，簡稱為CTAB)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS)等離子型表面活性劑，能溶解細胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離出來。再加入苯酚和氯仿等有機溶劑，能使蛋白質變性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很強，經離心后即可從抽提液中除去細胞碎片和大部分蛋白質。上清液中加入無水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物總DNA溶液。三、實驗材料水稻幼葉四、主要試劑配方2% CTAB抽提緩沖溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20m

17、l( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml滅菌, 冷卻后0.2-1% 2-巰基乙醇 （400ul）氯仿-異戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml異戊醇，搖勻即可。五、實驗步驟1.植物基因組DNA的提取提取緩沖液（CTAB Buffer）：CTAB 2（w/v）Tris-HCl（pH 8.0） 100 mMEDTA（pH 8.0） 20 mMNaCl 1.4 M提取步驟：(1) 將CTAB Buffer放于65 水浴中預熱，（大量提取則是同時將50 mL離心管置于冰上預冷）；(2) 將新鮮的葉片，無菌水洗后剪成小段，約0.15 g，

18、放到1.5 mL EP管中，EP管再開口放到液氮中，迅速用燒過的1 mL槍頭搗碎（大量提取則是取1 g葉片在液氮中迅速研磨成粉末）；(3) 向EP管中加入2%的預熱的CTAB緩沖液600 l，再加入巰基乙醇10 l至終濃度1%（v/v），迅速置于65 水浴1h，每隔5 min顛倒混勻；（大量提取則用在液氮中預冷過的藥匙迅速把磨碎的樣品轉移至預冷的50 mL離心管，立即加入10 mL預熱的CTAB Buffer；同時加入巰基乙醇至終濃度1%（v/v），在65 水浴中輕輕搖動1 h）；(4) 加入等體積的氯仿:異戊醇（24:1，v/v），室溫下顛倒離心管約100次（氣體過多時開蓋放氣），保證樣品與

19、溶液充分作用；室溫12 000 r/min，15 min（大提則是6 000 r/min離心15 min）；(5) 將上清轉移至另一個1.5 mL離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后靜置10 min。（大提則是加入至少2/3體積的異丙醇，同時加入NaAc至終濃度為0.1 M（每10 mL上清中加入7 mL異丙醇，580 l 3 M NaAc），輕輕旋轉混勻，-20 沉淀1-2 h）；(6) 用彎曲的Tip頭挑出團狀DNA并轉移至1.5 mL Eppendorf管中，6 000 r/min離心10 min，除去殘余液體；若無絮狀物質出現(xiàn)或者絮狀物質不易挑出則可以5 000 r/min 離心5 m

20、in；(7) 用預冷的70%乙醇（900 l）和0.1 M KAc/HAc pH 6.0（100 l）洗滌2次，低速離心（6 000 r/min，10 min或13 000 r/min，5-10 min）除去殘余液體；(8) 用預冷的無水乙醇浸泡DNA沉淀5 min，12 000 r/min離心5-10 min，除去上清，吸除管壁上殘余的乙醇，于37 干燥約15 min；(9) 用TE溶解干燥的DNA，加入RNase A至終濃度20 g/mL，37 過夜；若大提基因組則繼續(xù)以下步驟，小提基因組則到此步就結束；(10) 將DNA懸浮液轉移到15 mL具蓋離心管中，加入2 mL TE、1 mL 1

21、0 M NH4Ac和8 mL預冷的無水乙醇，輕輕混勻（如果此時管中小氣泡不夠多，說明提取的DNA量不多，需離心沉淀DNA）；(11) 用彎曲的Tip頭挑出團狀DNA并轉移至1.5 mL EP管中，用預冷的無水乙醇浸泡，于1 2 000 r/min離心5 min；(12) 盡可能除去管中多余液體，37 干燥5-10 min；用ddH2O重新溶解干燥的DNA；(13) 用紫外分光光度計測量DNA的濃度，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，-20 保存?zhèn)溆谩?. DNA質量檢測 瓊脂糖電泳檢測，原理和方法見實驗二。六、 注意事項 （1）葉片磨得越細越好。 （2）移液器的使用。 （3）由于植物細

22、胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作應迅速，以免組織解凍，導致細胞裂解，釋放出DNA酶，使DNA降解。思考題：1. 本實驗中所用到的各試劑的作用是什么? CTAB, 氯仿, 異丙醇, 75%乙醇, EDTA2提取基因組DNA的方法有哪些？各有何優(yōu)缺點？實驗5 多聚酶鏈式反應( polymerase chain reaction, PCR) 基因擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測一、 實驗目的 通過本實驗學習PCR反應的基本原理，掌握PCR的基本操作技術以及瓊脂糖凝膠電泳技術。二、 實驗原理PCR用于擴增位于兩端已知序列之間的DNA區(qū)段，即通過引物延伸而進行的

23、重復雙向DNA合成?；驹砑斑^程如下：PCR循環(huán)過程中有三種不同的事件發(fā)生：（1）模板變性；（2）引物退火；（3）熱穩(wěn)定DNA聚合酶進行DNA合成。1 變性：加熱使模板DNA在高溫下（94-95）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，即變性階段。2 退火：在體系溫度降至37-65，模板DNA與引物按堿基配對原則互補結合，使引物與模板鏈3端結合，形成部分雙鏈DNA，即退火階段。3 延伸：體系反應溫度升至中溫72，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導下，利用反應混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTP），按5到3方向復制出互補DNA，即引物的延伸階段。上述3步為一個循環(huán)，即高溫變性、低

24、溫退火、中溫延伸3個階段。從理論上講，每經過一個循環(huán)，樣本中的DNA量應該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經過2530個循環(huán)后DNA可擴增106109倍。典型的PCR反應體系由如下組分組成：DNA模板、反應緩沖液、dNTP、MgCl2、兩條合成的DNA引物、耐熱DNA Taq聚合酶。瓊脂糖凝膠電泳的原理：瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，沸水中溶解，45開始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性環(huán)境中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應與分子篩效應。不同DNA，其分子量大小及構型不同，電泳時的泳動率就不同，

25、從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關系。溴化乙錠（EB）為扁平狀分子，在紫外照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復合物，其發(fā)射的熒光強度較游離狀態(tài)EB發(fā)射的熒光強度大10倍以上，且熒光強度與DNA的含量成正比。用肉眼觀察，可檢測到5 ng以上的DNA。三、實驗材料及相關試劑 基因組DNA，基因特異性引物，PCR擴增相關試劑，等四、實驗步驟1模板DNA的抽提：實驗一所得的水稻基因組DNA。2PCR操作 (在冰上操作)： （1）PCR反應混合液的配制：反應體系25 L, 在無菌的0.2 mL離心管中按下列操作程序加樣：

26、以質?；蛱崛〉幕蚪M為模板，按順序加入以下試劑，建立20 l PCR反應體系：試劑（Reagent）體積（Volume，l）ddH2O13.010 PCR buffer2dNTP Mix (2.5 mmol/L each)2cDNA2上游引物（10 M）1下游引物 (10 M)1Taq DNA polymerase (5 U/l)0.5Total20（2）將反應混合液混勻, 然后每個PCR管中分裝24 L反應混合液，再加1 L模板DNA，最后加1滴石蠟油，防止水分蒸發(fā), 然后稍離心。（3）將PCR管放到PCR熱循環(huán)儀中，按下列程序開始循環(huán)：94 4 min (預變性) 94 30 sec, 6

27、0 30 sec, 72 2 min 72 7 min 35個循環(huán)（4）注意事項由于PCR靈敏度非常高，所以應當采取措施以防反應混合物受痕量DNA的污染。a. 所有與PCR有關的試劑，只作PCR實驗用，而不挪作它用。b. 操作中所用的PCR管、離心管、吸管頭等都只能一次性使用。c. 每加一種反應物，應換新的槍頭。3PCR產物的檢測： 瓊脂糖濃度（1.2%）；EB濃度（5 l / 100 ml TBE）（1）制膠（以150 mL為例） a. 稱取1.8 g 瓊脂糖，加入150 ml 的TBE緩沖液（pH 8.0），搖勻，用電子天平稱三角瓶的總重量。 b. 電爐上加熱，至瓊脂糖完全溶解；然后在天平

28、上加蒸餾水至原重量; c. 用凝膠將制膠板兩端封好，插入適當?shù)氖嶙?，將溶解的瓊脂糖（約50），倒入其中，直至厚度為46 mm（如有氣泡要把氣泡趕出），在室溫下冷卻凝固(約30 45 min)； d.將制膠板置于電泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保證點樣孔完好。 （2）點樣 a. 將2.0 l 溴酚藍加入到PCR產物中，然后稍微離心； b. 每孔點樣10.0 l，藍色樣品混合物將沉入點樣孔下部。（3）電泳 打開電源開關，調節(jié)電壓至35 V/cm(約100 V)，可見到溴酚藍條帶由負極向正極移動，約1小時后即可觀察。（4）染色 將電泳好的凝膠放入含EB的水溶液中, 染色15-20分鐘。（5）觀察將

29、電泳好的膠置于紫外透射檢測儀上，戴上防護觀察罩，打開紫外燈，可見到橙紅色核酸條帶，根據(jù)條帶粗細，可粗略估計該樣品DNA的濃度。如同時有已知分子量的標準DNA進行電泳，則可通過線性DNA條帶的相對位置初步估計樣品的分子量。（6）注意事項a. 煮膠時，膠液的量不應超過三角瓶容量的1/3，否則易溢出。 b. 煮好的膠應冷卻至50左右時再倒，以免制膠板變形，并減少漏膠的機會。c. 倒膠注意厚度（4-6 mm），充分凝固后再拔出梳子，以保持齒孔形狀完好。也可待膠稍凝固后，放入4冰箱10多分鐘，以加速膠的凝固。d. 加樣前趕走點樣孔中的氣泡，點樣時吸管頭垂直，切勿碰壞凝膠孔壁，以免使帶型不整齊。e. 一般

30、情況下不必每點一個樣品都換槍頭，吸電泳緩沖液洗幾次即可再點下一個樣品。凝膠中含有EB，切勿直接用手接觸膠，廢棄膠應集中處理，勿亂丟。思考題：1 PCR反應液中主要成分是哪些？在PCR反應過程中各起什么作用？2 為什么在PCR反應過程中，使用三個不同的溫度變化？3 用PCR擴增目的基因，要想得到特異性產物需注意哪些事項？實驗6 RT-PCR（設計性實驗）實驗設計目的：掌握RT-PCR的基本原理； 了解利用RT-PCR分析目的基因表達的方法。RT-PCR原理：1、 提取RNA，進行反轉錄，然后以cDNA為模板進行PCR；2、 在一定范圍內，PCR產物的亮度與cDNA為模板的濃度成正比；3、 根據(jù)P

31、CR產物的亮度變化，可推測目的基因在mRNA水平上的表達量的變化趨勢。研究課題：在研究煙草抗花葉病毒（TMV）過程中，從煙草葉片中克隆到一個cDNA片段，已完成DNA序列的測定?，F(xiàn)提供煙草種子、TMV及相關的RT-PCR試劑，擬利用RT-PCR技術分析該基因在TMV侵染煙草過程中的表達模式，從而推測該基因在煙草抗TMV過程中可能具有的功能。實驗設計要求：要求給出比較詳細周全的實驗方案，可以是技術路線的形式，但不要求一一列出具體的實驗步驟。重要提示：1、 如何處理相關的實驗材料以分析目的基因在時間維度上的表達模式？2、 如何保證RT-PCR產物形成量與模板濃度成正比？3、 如何保證RT-PCR的

32、模板用量以致？思考題：1、 什么是RT-PCR？有何應用價值？2、 與Northern雜交相比，RT-PCR分析基因的表達模式時有何優(yōu)缺點？實驗7 RT-PCR擴增目的基因【實驗目的】1掌握真核生物細胞基因組RNA制備和定量的基本方法。2掌握反轉錄PCR的原理及實驗方法。3掌握PCR技術原理和基本實驗步驟。【實驗原理】聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)是利用兩已知序列的寡核苷酸作為上、下游引物,在耐熱性DNA聚合酶(Taq酶)作用下將位于模板DNA上兩引物間特定DNA片段進行一種指數(shù)級增長的復制過程。PCR反應體系由模板DNA、引物、耐熱性DNA聚合酶、

33、底物(四種dNTP)、緩沖液和Mg2+等組成。其操作過程為變性、退火、延伸等三個步驟循環(huán)進行。其中變性是加熱條件下模板DNA雙鏈間的解離,退火是降低溫度使模板DNA與高濃度引物間的互補結合,延伸是在耐熱性DNA聚合酶和Mg2+等存在下擴增特定的DNA片段。每次循環(huán)擴增產物又可作為下一循環(huán)的模板,因此理論上每經過一輪變性、退火、延伸三個步驟,特定DNA片段的分子數(shù)目增加一倍。耐熱性DNA聚合酶的應用使PCR循環(huán)反應可自動進行,提高了反應的特異性和效率。引物設計是PCR技術的關鍵步驟，直接影響擴增的效率和特異性。同時，通過適當改變引物的設計可實現(xiàn)多種PCR技術，現(xiàn)在利用計算機軟件可輔助設計某一己知

34、序列基因的特定引物。PCR是一種體外大量擴增特異DNA片段的分子生物學技術,具有省時、操作簡便、特異性強、靈敏度高、效率高、應用范圍廣等特點。PCR技術在醫(yī)學、分子生物學領域得到廣泛應用，如應用于DNA克隆、突變分析、基因融合、基因半定量、遺傳性疾病的診斷等方面。PCR技術還可與其它分子生物學技術相結合發(fā)展產生新的技術，如反轉錄PCR(RT-PCR)、反向PCR(IPCR)、不對稱PCR等,使PCR在科研及臨床上的應用得到更大發(fā)展。反轉錄（reverse transcription）也稱為逆轉錄，是依賴RNA的DNA合成作用，以RNA為模版，由dNTP聚合成DNA分子。反應過程先以單鏈RNA的

35、基因組為模板，催化合成一條單鏈DNA。產物與模板生成RNA:DNA雜化雙鏈，雜化雙鏈中的RNA被RNA酶水解后，再以新合成的單鏈DNA為模板，催化合成第二鏈的DNA。催化此反應的酶稱為逆轉錄酶，也稱反轉錄酶。反轉錄-聚合酶鏈反應 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)是PCR技術的一種廣泛應用的形式，原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高

36、了幾個數(shù)量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術主要用于：分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統(tǒng)。本實驗通過提取培養(yǎng)細胞的總RNA，以反轉錄酶進行反轉錄反應獲得cDNA，作為PCR的模板擴增人3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因中一段300bp的DNA片段，兩個引物的5末端分別引入EcoR I和BamH I的酶切位點，為DNA重組實驗做準備?！緦嶒瀮热菖c方法】1反轉錄反應1）于冰上將3 l總RNA，2 l oligo18T (0.5 g/l)和7 l ddH2O按總體積12 l混勻，瞬時離心收集液體；2）70 加熱變性5 min，置于冰浴中迅速冷

37、卻，瞬時離心收集液體；3）在冰上按順序加入下列組分：試劑（Reagent）體積（Volume，l）5 reaction buffer5dNTP mix (2.5 mmol/L each)5RNase inhibitor(40U/l)0.44）輕輕混勻離心；5）加入M-MuLV逆轉錄酶（200 U/l）1 l，補水至 25 l；6）42 溫育1 h；7）70 加熱10 min以終止反應，冰上冷卻。產物保存于-20 備用。.4 PCR以cDNA為模板，按順序加入以下試劑，建立20 l PCR反應體系：試劑（Reagent）體積（Volume，l）ddH2O13.010 PCR buffer2dNT

38、P Mix (2.5 mmol/L each)2cDNA2上游引物（10 M）1下游引物 (10 M)1Taq DNA polymerase (5 U/l)0.5Total20混合均勻后按下列條件進行反應：Stage 1：94 5 min 1 cycleStage 2：94 30 s53 40 s72 1 min 35 cyclesStage 3： 72 7 min 1 cycleStage 4 4 （6）結果分析：1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。取10L PCR產物加入6上樣緩沖液2L混勻,同時以DNA分子量標準為對照，分別上樣后在0.5TBE電泳緩沖液中于15V/cm電壓下電泳1h, 用紫外檢測儀檢查，與DNA分子量標準對照分析。在相當于PCR產物大小的位