62-EB病毒(EBV)核酸檢測標準操作規(guī)程(熒光PCR法)

1、北京泰普舜康醫(yī)學檢驗所作業(yè)指導書編號： BJTIB-SOP-PCR062第一版EB病毒（EBV）核酸檢測標準操作規(guī)程（熒光PCR法）第 3 頁 共 6頁第 0次修改EB病毒（EBV）核酸檢測標準操作規(guī)程（熒光PCR法）1. 目的規(guī)范EB病毒核酸DNA（熒光PCR法）檢測操作流程，準確進行EB病毒DNA分析。2. 應用范圍使用中山大學達安基因股份有限公司EB病毒核酸擴增（PCR）熒光定量檢測試劑盒（熒光PCR法）和Mx3000P熒光定量PCR儀、Roche480熒光定量PCR儀進行EB病毒DNA檢測。3. 職責由 PCR實驗室制定程序文件，專業(yè)技術人員負責執(zhí)行，實驗室主管負責監(jiān)督實施。4. 內(nèi)容

2、4.1 實驗原理及其臨床應用本試劑盒用一對EB病毒（EBV）特異性引物和一條EB病毒（EBV）特異性熒光探針，配以PCR反應液、耐熱DNA聚合酶（Taq酶 ）、核苷酸單體（dNTPs）等成分，用PCR體外擴增法檢測EB病毒（EBV） DNA。用于人血中EB病毒DNA的測定，為臨床提供參考，4.2 標本采集4.2.1 使用標本類型：全血。4.2.2 標本采集；由合作單位按照以下要求進行采集。4.2.2.1 全血： 用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2毫升，注入EDTA乙二胺四乙酸二鈉（）或枸櫞酸鈉抗凝劑的玻璃管，立即輕輕顛倒玻璃管混合5-10次，使抗凝劑與靜脈血充分混勻，密閉送檢。4.2.3 標

3、本保存和運送：標本可立即用于測試，也可以保存于-20待測，保存期為6個月。標本運送采用0冰壺。4.3 試劑準備4.3.1 供應商：中山大學達安基因股份有限公司。4.3.2 此實驗試劑應放在冰箱-20保存，在實驗前5分鐘取出備用，實驗后應立即放回冰箱 -20 。4.3.3 如果試劑出現(xiàn)了封口蠟破損導致液體外漏以及過期試劑，應及時更換。4.4 質(zhì)控品4.4.1 質(zhì)控品來源：隨試劑盒，由廠家提供。4.4.2 質(zhì)控品保存條件：置于-20冰箱中保存。4.4.3 質(zhì)控頻度：每次實驗均需做質(zhì)控。4.5 操作過程說明4.5.1 DNA提取4.5.1.1 質(zhì)控品處理：取出陰性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品、強陽性質(zhì)控品

4、。8000rpm離心數(shù)秒，吸 50ul 至 0.5ml 滅菌離心管中，加入50ulDNA提取液充分混勻，100恒溫處理10± 1分鐘； 12000 rpm離心5分鐘，備用。4.5.1.2 樣本處理4.5.1.2.1 取全血 500ul至干燥玻璃試管中，加入生理鹽水500ul輕搖混勻；4.5.1.2.2 取干燥玻璃試管加入1ml淋巴細胞分離液；4.5.1.2.3 將稀釋好的全血用移液器緩慢加入加有淋巴細胞分離液的試管中（注意沿著管壁，速度要慢） ；4.5.1.2.4 2000rpm 離心 20分鐘（建議用水平離心機）；4.5.1.2.5 吸取白細胞層（從上往下第二層），加入1.5ml

5、離心管，12000rpm離心5分鐘；4.5.1.2.6 去上清，沉淀中加入50ulDNA提取液充分混勻，100恒溫處理10± 1分鐘；12000rpm離心5分鐘，上清備用。4.5.2.1 加樣：取PCR反應管若干，加入處理后的樣品（標本、陰性質(zhì)控品、臨界或強陽性質(zhì)控品）上清液5ul,8000rpm 離心數(shù)秒，放入儀器樣品槽。4.5.3 PCR擴增將準備好的PCR反應管放置于PCR儀上，編輯樣本信息并按下列循環(huán)參數(shù)進行擴增反應：37 -2min ； 94 -2min ；（94 -15ses ； 55 -45ses ）×40 cyclics ；EBV 檢測熒光素：FAM; 反應

6、體系：50ul ； 熒光信號收集：55 -45ses， 末端收集。4.5.3 Mx3000P 熒光定量PCR儀的設置及結果分析4.5.3.1 打開計算機電源。4.5.3.2 將 Mx3000P電源開關打開，在大約1分鐘的時間內(nèi)，儀器將會自檢并且能聽到濾鏡輪轉(zhuǎn)動的聲音。打開電腦上的Mx3000P軟件，確定軟件界面右下面的聯(lián)機標志呈現(xiàn)綠色。如果不是綠色而是紅色，軟件會提示待儀器自檢完成， 這時只需要繼續(xù)稍等片刻，會自動連接計算機。北京泰普舜康醫(yī)學檢驗所作業(yè)指導書編號： BJTIB-SOP-PCR062第一版EB病毒（EBV）核酸檢測標準操作規(guī)程（熒光PCR法）第 12頁共 6頁第 0次修改4.5.

7、3.3 在軟件的彈出框中選擇您要進行的實驗類型，通常選擇第一項“ Quantitive PCR （ Multiple Standards ）”進行絕對定量分析。4.5.3.4 確定鹵鎢燈已經(jīng)打開。（綠色 ）則說明鹵鎢燈已經(jīng)打開；（黃色）則說明鹵鎢燈正在預熱；（紅色）則說明鹵鎢燈沒有被打開，這時需要用鼠標點擊這個標志將光源打開。在鹵鎢燈已經(jīng)被打開的情況下，軟件界面右下方會顯示（綠色）。4.5.3.5 最好在儀器與光源預熱20分鐘后開始實驗。4.5.3.6 在里， 對所選孔進行設定，在 Well type中設定 Standard品） 、 NTC（陰性對照）、 unkown（樣品）等， 并選擇正確的

8、熒光通道（ FAM,HEX, ROX， Cy5），參比熒光（Reference dye）選None。對于標準品，在Well typeStandard ”后，再設定其模板濃度。方法為：點擊10倍的濃度梯度可以直接點擊， 在下拉菜單中選擇不同的系數(shù)關系后，依次點擊設定為標準品在一欄， 手工輸入濃度。若要對不同的樣品進行編號，就能顯示樣品編號。則雙擊所選孔，在name框中輸入樣品號，點擊或者點擊版面右上方的，導入以前使用的96孔板設定。4.5.3.7 點擊， 進行PCR循環(huán)的設定，可以直接點擊溫度、變各項溫度、時間、循環(huán)數(shù)等。在選定大步驟之后添加步驟可選定該大步驟后，點擊， 或點擊鼠標右鍵，在彈出的

9、對話框中，選擇Add Segment，Add Plateau則可在該大步驟之后添加一個大步驟；若是在選定大步驟里面的小步驟后邊添加with Ramp”?！?，或者點要刪除某個大步驟，直接選定大步驟，點擊界面右邊的“擊鼠標右鍵選Delete ，即可刪除該步驟。如果要刪除一個大步驟里的小步驟，可 先選定此步驟時間和溫度中間的橫線，將其變紅，如圖”，或者點擊鼠標右鍵選 Delete ，即可刪除該步驟。點擊，導入以前設定的PCR程序。（ END）代表在這一步結束時采集熒光信號；（ ALL）代表在這一步的全過程都采集熒光信號，一般用作熔解曲線分析?？芍苯佑檬髽藢⒋藞D標拖到要采集信號的地方。若要去除，可將其

10、拖出循環(huán)設定區(qū)域。4.5.3.8 結束之后，點擊軟件界面右上方的。會彈出對話框提示：儀器燈源正在預熱，需要“馬上運行”或者是“燈預熱完成后再運行”？通常可直接點擊“馬上運行”，但最好點擊“燈預熱完成后再運行”，可以保護燈源。軟件界面右下方會出現(xiàn)運行狀態(tài)顯示框Run Status ，點擊 Start 開始實驗。在運行過程中可以通過點擊Add Cycles來增加擴增的循環(huán)數(shù)。還可以選擇勾選“ Turn lampoff at end of run ”，在PCR運行結束之后軟件將自動關閉鹵鎢燈。4.5.3.9 在 PCR運行的過程中可以點擊，觀察樣品的實時擴增原始結果。4.5.3.10 PCR 運行結

11、束后，點擊， 再點擊 Results ， 軟件將自動進行結果分析，也可點擊手動進行結果分析?？梢允謩诱{(diào)節(jié)閾值線（拖動）進行分析。點擊可顯示標準曲線，看斜率、截距、線性相關是否在可控范可選擇相應的熒光觀察擴增可根據(jù)自己的需要選擇顯示的界面。是擴增曲線，Ct值列表，標準樣本起始濃度，結果 excel 表格輸出，合并面板，包括設置、程序設定、樣本Ct值、擴增曲線四個面板。4.5.3.11分析曲線時，如果曲線不夠光滑，還能用Smoothing對曲線進行調(diào)節(jié)，一般 Amplification average是 3， 可按需要將其調(diào)至較大數(shù)值，如 5、 7、 9， 調(diào)整后曲線將更光滑，不過Ct值會稍微靠后

12、一點，使數(shù)據(jù)失真，通常情況下，不建議這么做。4.5.3.12如果需要對每條曲線進行單獨的基線設置，點擊Baseline Correction ，點擊 Adaptive baseline ，在下面對應的各孔，單獨進行 基線起始和終止位置的調(diào)節(jié)。4.5.3.13 關于Mx3000P調(diào)用前一次實驗標準曲線的補充說明。點擊桌面Mx3000P的軟件圖標，彈出話框：選擇Multiple Experiment Analysis （多項實驗結果分析）選項，點擊“OK”，出現(xiàn)如下對話框，建議選擇“Use common threshold ”進行分析進算，然后點擊，導入需要一起分析的上機文件，點擊Finish ”

13、即可。4.5.3.14 這里選擇時要注意：1. 兩個或者多個實驗結果要有相同的實驗程序； 2. 每次程序中的循環(huán)數(shù)應該一致。在分析欄可以選擇不同實驗的不同反應孔進行同步分 析。4.5.3.15 分析質(zhì)控結果：陰性質(zhì)控品：EBV（FAM）C值t = 40或“ No Ct”。陽性質(zhì)控品：EBV（ FAM） Ct值 <33，且有較好的對數(shù)增長曲線。以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則本次實驗無效，需重新檢測。4.5.3.16 記錄實驗數(shù)據(jù)。4.5.3.17 取出結束后擴增儀內(nèi)擴增產(chǎn)物需用一次性手套包好、封口后， 丟入醫(yī)療廢物垃圾桶內(nèi)，以防止擴增管破裂而導致污染。4.5.4 Roche480

14、熒光定量PCR儀的設置及結果分析4.5.4.1 先打開電腦，再打開熒光定量PCR儀器，然后雙擊圖標“”，打開儀器數(shù)據(jù)庫。4.5.4.2 雙擊圖標“ ”，啟動羅氏480軟件。4.5.4.3 在彈出的對話框中，輸入用戶名和密碼，進入軟件設置界面。4.5.4.4 在彈出的界面中，點擊“ ”，進入新的實驗設置界面：4.5.4.5在“4.5.4.6將“4.5.4.7將“4.5.4.8在“”菜單欄里，“Detection Format”子菜單下?！边x擇為 Daul或 3 color 的探針雜交類型。Reaction Volume ”設置為“50ul ”。Programs”下：通過“”“”來增加總的循環(huán)階段

15、及階段的循環(huán)數(shù)，并在“變性延伸退火”循環(huán)階段的“Analysis Mode ”下選擇 Quantification4.5.4.9在“Temperature Targets ”下：通過“”“”來增加每個循環(huán)階段里的小步驟，并在采集熒光的小步驟的“Acquisition Mode ”里選擇“single ”，采集熒光。4.5.4.10在“”菜單欄下，通過“ ”增加或者減少實驗項目類型，通過右邊的孔位選擇，設置不同項目的區(qū)域，然后點擊“Apply ”保存。4.5.4.11 在“ ”菜單欄下， Step 1 處，選擇“Abs Quant”；Step 2 處，編輯標準品及樣本。4.5.4.12 標準品設

16、置：在Step 2下的96孔面板中，選中標準品反應孔，然后選擇右側(cè)的模板檢測通道，如 “ 483-533” ， 然后將下方孔位的“ QuantificationSample Type”選擇為“ Standard ”，并在“Concentration ”處輸入其濃度即可。4.5.4.13 樣本設置：類似于標準品設置，但僅需要編輯其“Sample Name”即可。4.5.4.14 返回“ ”菜單，在“ ”子菜單右下角點擊4.5.4.15 實驗結束后，在“ ”菜單下，選擇“Abs Quant/Fit Points ”，進入結果分析界面：Analysis 】：在此菜單下對閾值線進行調(diào)整； Noise

17、Band】：對實驗的信噪比進行調(diào)整； Filter Comb 】：對不同熒光通道進行選擇； Std Curve 】：對定量參考品進行選擇，包括實驗中的參考品、導入的標準品等；4.5.4.16在上述操作完成后，點擊“報告中需包含的項目，然后得出結果。北京泰普舜康醫(yī)學檢驗所作業(yè)指導書編號： BJTIB-SOP-PCR062第一版EB病毒(EBV)核酸檢測標準操作規(guī)程(熒光PCR法)第 8頁共 6頁第 0次修改4.5.4.17 分析質(zhì)控結果：陰性質(zhì)控品：EBV(FAM)C值t = 40或“No Ct”。陽性質(zhì)控品：EBV( FAM) Ct值 <33。以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則本次實驗無效，需重新檢測。4.5.4.18 記錄實驗數(shù)據(jù)。4.5.4.20 取出結束后擴增儀內(nèi)擴增產(chǎn)物需用一次性手套包好、封口后， 丟入醫(yī)療廢物垃圾桶內(nèi)，以防止擴增管破裂而導致污染。4.5.4.21 關閉擴增儀電源和計算機電源。4.6 結果判定EBV陽性：(EBV-FAM) Ct 36，且有較好的對數(shù)增長曲線。EBV陰性：( EBV- FAM) Ct值 =40或者“ No Ct” (Mx3000P)或者“ Undet. ” (ABI 7500)EBv檢測灰度區(qū)：(EBV-