蛋白質(zhì)分離技術(shù)-層析

1、蛋白質(zhì)分離技術(shù)蛋白質(zhì)分離技術(shù)-層析層析上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院倪培華倪培華 副教授副教授分子極性分子極性分子大小分子大小分子形狀分子形狀離子親和力離子親和力分子親和力分子親和力吸附能力吸附能力凝膠層析凝膠層析離子交換層析離子交換層析親和層析親和層析2 2、物理化學(xué)性質(zhì)間的差異、物理化學(xué)性質(zhì)間的差異吸附層析吸附層析支持物支持物含待分離物質(zhì)含待分離物質(zhì)氣氣相相層層析析液液相相層層析析氣氣- -固固 氣氣- -液液 液液- -固固 液液- -液液二二. .層析技術(shù)的分類層析技術(shù)的分類1. 1. 按兩相所處的狀態(tài)分類按兩相所處的狀態(tài)分類以氣體作為流動(dòng)相以氣體作為流動(dòng)相以液體作為流動(dòng)相以液體

2、作為流動(dòng)相 在單位時(shí)間內(nèi)被吸附于吸附劑的某一表面積上的分子和在單位時(shí)間內(nèi)被吸附于吸附劑的某一表面積上的分子和同一單位時(shí)間內(nèi)離開此表面的分子之間可以建立動(dòng)態(tài)平衡，同一單位時(shí)間內(nèi)離開此表面的分子之間可以建立動(dòng)態(tài)平衡，吸附層析就是不斷地產(chǎn)生平衡與不平衡，吸附與解吸。吸附層析就是不斷地產(chǎn)生平衡與不平衡，吸附與解吸。硅膠聚酰胺氧化鋁 活性炭磷酸鈣,3.3.按制備量分類按制備量分類 ：圓形濾紙長(zhǎng)條濾紙薄層層析(TLC)柱層析容量變大容量更大加展開液薄層層析薄層層析 溶質(zhì)在固定相中的濃度溶質(zhì)在固定相中的濃度 CsCsK= K= = = 溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度 CmCm 特定的溫度：常數(shù)特定

3、的溫度：常數(shù) K K大：被固定相吸附的牢固，隨流動(dòng)相大：被固定相吸附的牢固，隨流動(dòng)相 的移動(dòng)速度較慢。的移動(dòng)速度較慢。凝膠過濾凝膠過濾 （gel filtrationgel filtration）(Porath, Flodin, 1959)分子篩層析（分子篩層析（molecular sieve chromatographymolecular sieve chromatography） (Hjertn, Mosbach, 1962)排阻層析排阻層析 （exclusion chromatographyexclusion chromatography）(Pedersen, 1962) 指混合物隨流動(dòng)

4、相經(jīng)固定相的層析柱時(shí)，指混合物隨流動(dòng)相經(jīng)固定相的層析柱時(shí)，混合物中各組份按其分子大小不同而被分離混合物中各組份按其分子大小不同而被分離的技術(shù)。的技術(shù)。 A good gel for gel filtration contains about95% water 固定相流動(dòng)相小分子被延滯小分子大分子較快流出 分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)： 分子大小不同分子大小不同, ,在凝膠受到的在凝膠受到的阻滯作用有差阻滯作用有差異異, ,從而造成各從而造成各組分在凝膠柱組分在凝膠柱中的遷移速度中的遷移速度不同得到分不同得到分離。柱床體積柱床體積VT凝膠干體積凝膠干體積Vg內(nèi)水體積內(nèi)水體積Vi存在于柱床內(nèi)凝膠存在于柱床

5、內(nèi)凝膠外面空隙之間的水外面空隙之間的水相體積，相應(yīng)于一相體積，相應(yīng)于一般層析法中流動(dòng)相般層析法中流動(dòng)相的體積。的體積。顆粒內(nèi)部所含水相顆粒內(nèi)部所含水相的體積它可從干凝的體積它可從干凝膠顆粒重量和吸水膠顆粒重量和吸水重量相減求得。重量相減求得。凝膠體積以及顆粒內(nèi)凝膠體積以及顆粒內(nèi)外間隙體積的總和。外間隙體積的總和。 VT = 1/4 D2h 外水體積外水體積V0V VT T = Vg + V= Vg + V0 0 + Vi+ Vi數(shù)理關(guān)系數(shù)理關(guān)系 VeVe -Vo-Vo Kd Kd = = Vi Vi6、分配系數(shù)（、分配系數(shù)（ Kd ）：）：特點(diǎn)：特點(diǎn)：（1）與被分離物質(zhì)分）與被分離物質(zhì)分子的大

6、小和凝膠顆粒子的大小和凝膠顆?？紫兜拇笮∮嘘P(guān)孔隙的大小有關(guān) （2）與柱的長(zhǎng)短粗細(xì)）與柱的長(zhǎng)短粗細(xì)無關(guān)無關(guān) (2)Ve = Vo + Vi(2)Ve = Vo + Vi Kd Kd = 1 = 1n分子完全不被排阻分子完全不被排阻n完全向凝膠顆粒內(nèi)完全向凝膠顆粒內(nèi)部擴(kuò)散部擴(kuò)散n在兩相分配的比值在兩相分配的比值為為1, 1,最后流出最后流出. .(1)Ve = Vo(1)Ve = Vo Kd Kd = 0 = 0n分子完全被排分子完全被排阻于凝膠顆粒阻于凝膠顆粒之外之外n全部分布于流全部分布于流動(dòng)相里動(dòng)相里, ,n最先流出。最先流出。(3) 0 Kd 1 (3) 0 Kd 2.2.離子交換纖維素離子交換纖維素操作過程：操作過程： 1. 1.裝柱；裝柱； 2.2.離子交換；離子交換； 3.3.洗脫洗脫考慮因素：考慮因素：根據(jù)分離過程的實(shí)驗(yàn)條件根據(jù)分離過程的實(shí)驗(yàn)條件 強(qiáng)酸強(qiáng)堿強(qiáng)酸強(qiáng)堿應(yīng)用廣泛應(yīng)用廣泛 弱酸型弱酸型只能在堿性范圍內(nèi)使用只能在堿性范圍內(nèi)使用 弱堿型弱堿型只能在酸性范圍內(nèi)使用只能在酸性范圍內(nèi)使用（二）緩沖液的選擇（二）緩沖液的選擇( (三三) )洗脫劑洗脫劑實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)： 離子交換層析分離氨基酸離子交換層析分離氨基酸一、原理：一、原理：Dowex50陽離子交換樹脂陽離子交換樹脂 +-一、操作注意點(diǎn)：一、操作注意點(diǎn)：1、裝柱和加樣同凝膠層析、裝柱和加樣同凝膠層析 2、洗脫液