層析技術(shù)簡(jiǎn)介

1、第八章 層析分離技術(shù)生物分離過程的一般流程v 層析技術(shù)(chromatography)又稱色譜法，俄國(guó)植物學(xué)家Michael Tswett于1906年首先創(chuàng)建v 1938年俄國(guó)人首先實(shí)現(xiàn)了在氧化鋁薄層上分離一種天然藥物 v 1941年Martin 和Synge發(fā)現(xiàn)了液液（分配）色譜liquid- lipuid (partition)chromatography, LLC第一節(jié) 層析技術(shù)概述一、層析的基本原理v （一）基本原理 層析分離是一種物理的分離方法，利用多組分混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同的程度分布在兩個(gè)相中。v 優(yōu)點(diǎn)：（l）分離效率高。v （2）應(yīng)用范圍廣。v （3）

2、選擇性強(qiáng)。v （4）設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便。v 缺點(diǎn)：處理量小、操作周期長(zhǎng)、不能連續(xù)操作，因此主要用于實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)生產(chǎn)上還應(yīng)用較少。（三）層析的基本概念v 1.固定相v 2.流動(dòng)相v 3.分配系數(shù)及遷移率（或比移值）v 4.分辨率（或分離度）v 5.正相色譜與反相色譜v 6.操作容量（或交換容量）二、層析分離技術(shù)的分類1.吸附層析2.分配層析3.凝膠過濾（分子篩）4.離子交換層析5.親和層析6.疏水層析三、柱層析基本操作技術(shù)1.裝柱2.平衡3.加樣4.洗脫5.流速控制6.分部收集7.洗脫峰檢測(cè)、合并收集8.層析介質(zhì)的再生第二節(jié) 吸附層析 (absorption chromatography) 一、

3、吸附層析的原理與特點(diǎn)v 吸附是利用吸附劑對(duì)液體或氣體中某一組分具有選擇吸附的能力，使其富集在吸附劑表面，而從混合物中的分離的的過程。v 典型的吸附過程包括四個(gè)步驟：吸附的類型（1） 物理吸附: 放熱，可逆，單分子層或多分子層，選擇性差（2） 化學(xué)吸附: 放熱量大，單分子，選擇性強(qiáng)（3） 交換吸附: 吸附劑吸附后同時(shí)放出等當(dāng)量的離子到溶液中吸 附 法特點(diǎn)v （1） 不用或少用有機(jī)溶劑v （2） 操作簡(jiǎn)便、安全、設(shè)備簡(jiǎn)單v （3） 生產(chǎn)過程pH 變化小v （4） 從稀溶液分離溶質(zhì)v （5） 吸附劑對(duì)溶質(zhì)的作用小v （6） 吸附平衡為非線性v （7）選擇性較差吸附法的應(yīng)用v 氣體

4、過濾v 水處理v 脫色、除臭v 目標(biāo)產(chǎn)物的分離二、吸附劑（固定相）的選擇v 吸附劑通常應(yīng)具備以下特征：§ 表面積大、顆粒均勻、§ 對(duì)被分離的物質(zhì)具有較強(qiáng)的吸附能力§ 有較高的吸附選擇性§ 機(jī)械強(qiáng)度高§ 再生容易、性能穩(wěn)定§ 價(jià)格低廉。v 常用的吸附劑有極性的和非極性的兩種。 羥基磷灰石、硅膠、氧化鋁等屬前者，活性炭屬后者。 人工合成的如大網(wǎng)格吸附劑、分子篩等兩種都有。但大多屬非極性的。常用的吸附劑v 1大網(wǎng)格聚合物吸附劑：v 2活性碳：助濾，脫色，去熱原v 使用:偏酸性(pH 5-7),加熱(50-60) 攪拌30minv 活性白土：

5、脫組胺類過敏物，脫色。v 硅藻土：助濾，澄清1.大網(wǎng)格聚合物吸附樹 脂 的 網(wǎng) 絡(luò) 骨 架大網(wǎng)格吸附樹脂v 大網(wǎng)格吸附樹脂適合于提取各種有機(jī)化合物。在抗菌素工業(yè)中，用于頭孢菌素、維生素B12、林可霉素的提取。大網(wǎng)格吸附劑結(jié)構(gòu)與類型v 按骨架極性：v 非極性（苯乙烯-二乙烯苯）v 中等極性（甲基丙烯酸酯）v 極性 (硫氧基、酰胺、N-O基、磺酸基)v 孔隙度：吸附劑中空隙所占百分比v 孔容：每g吸附劑所含的空隙體積v 骨架密度(真密度)：吸附劑每ml骨架（不包括空隙)的重量。v 濕真密度：空隙充滿水時(shí)的密度大網(wǎng)格吸附劑吸附條件選擇1 吸附劑的選擇（相似互溶） ：v 非極性吸附劑從極性溶劑中吸附非

6、極性物質(zhì)v 高極性吸附劑從非極性溶劑中吸附極性物質(zhì)v 中等極性吸附劑對(duì)兩種情況均有吸附能力v 孔徑與比表面（孔徑6倍于分子直徑） 吸附法提取的生化物質(zhì)大多是弱極性或非極性，一般選非極性或中等極性。大孔吸附劑解吸條件v 1. 選擇洗脫劑原則 a. 洗脫劑應(yīng)容易溶脹大網(wǎng)格吸附劑。 溶劑的溶解度參數(shù)和聚合物的溶解度參數(shù)接近時(shí)，溶劑愈易溶脹聚合物。 （d洗 » d聚） 聚苯乙烯等聚合物的溶解度參數(shù)約為18.4v b. 洗脫劑對(duì)被吸附物有較大的溶解度 大孔吸附樹脂的應(yīng)用1 生化制藥方面的應(yīng)用v 抗生素分離純化（再生容易、產(chǎn)品灰分少）：-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、肽類、博萊霉素類、含氮雜

7、環(huán)類及其他新抗生素v 維生素的提取純化： VB12，VB2，VC v 天然產(chǎn)物的分離：生物堿，黃酮，多糖，苷類 、紅景天甙等v 生化藥物：酶, 氨基酸, 蛋白質(zhì), 肽,甾體2 活 性 炭（Active carbon）活性炭對(duì)物質(zhì)的吸附規(guī)律v 活性炭是極性吸附劑，因此在水中吸附能力大于有機(jī)溶劑中的吸附能力。v 針對(duì)不同的物質(zhì)，活性炭的吸附遵循以下規(guī)律：（1）對(duì)極性基團(tuán)多的化合物的吸附力大于極性基團(tuán)少的化合物（2）對(duì)芳香族化合物的吸附能力大于脂肪族化合物（3）對(duì)相對(duì)分子量大的化合物的吸附力大于相對(duì)分子量小的化合物（4）pH 值的影響 堿性 中性吸附 酸性洗脫 酸性 中性吸附 堿性洗脫（5）溫度 未

8、平衡前 隨溫度升高而增加3氧化鋁氧化鋁的吸附能力很強(qiáng)，可以活化到不同程度，重演性好，再生容易，故是常用的吸附劑之一。氧化鋁的活性與其含水量有很大的關(guān)系。水分會(huì)掩蓋活性中心，故含水量愈高，活性愈低。分酸性、堿性和中性三種，v 酸性氧化鋁(pH4-5)適合于分離酸性化合物，v 堿性氧化鋁(pH9-10)適合于分離堿性化合物，v 中性氧化鋁(pH7)適合于分生物堿、揮發(fā)油、萜類、甾體及在酸、堿中不穩(wěn)定的甙類、酯類等化合物。 4硅膠v 硅膠是應(yīng)用很廣的一種極性吸附劑。是具有硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu)，表面有許多硅醇基的多孔性微粒。硅醇基可與極性化合物或不飽和化合物形成氫鍵而使硅膠具較強(qiáng)的吸附力。 v 主要優(yōu)點(diǎn)是化學(xué)

9、惰性，具有較大的吸附量，易制備不同類型的多孔硅膠，一般以SiO2.xH2O通式表示。v 硅膠的活性與含水量有關(guān)：含水量高則 吸附力減弱。當(dāng)游離水含量17%以上時(shí)， 吸附能力極低，可作為分配色譜的載體v 硅膠具有微酸性，適用于分離酸性和中 性物質(zhì)，如有機(jī)酸、氨基酸、甾體等。5羥基磷灰石（磷酸鈣）v 在無機(jī)吸附劑中，磷酸鈣是唯一的適用于生物活性高分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、核酸）的分離的吸附劑。v 羥基磷灰石主要適用于蛋白質(zhì)的層析分離，也適用于較小的核酸，如轉(zhuǎn)移RNA的分離。v 用0.5mol/L CaCl2加 0.5mol/L磷酸二鈉鹽，在室溫下反應(yīng)，得到滿意的流速的磷酸鈣。CaHPO4.2H2O在pH

10、 7以上，慢慢變?yōu)榱u基磷灰石，即Ca5(PO4)3OH放出H3PO4。吸附操作技術(shù) 固定床吸附操作膨脹床吸附操作流化床吸附操作模擬/移動(dòng)床吸附操作攪拌釜吸附操作第三節(jié) 凝膠柱層析利用凝膠層析介質(zhì)(固定相)交聯(lián)度的同所形成的網(wǎng)狀孔徑的大小，在層析時(shí)能阻止比網(wǎng)孔直徑大的生物大分子通過。利用流動(dòng)相中溶質(zhì)的分子量大小差異而進(jìn)行分離的一種方法，稱之為排阻層析。 第五節(jié) 凝膠柱層析一、凝膠層析的原理 二、凝膠的種類 1.葡聚糖凝膠2.瓊脂糖凝膠3.聚丙烯酰胺凝膠三、凝膠柱層析的操作與應(yīng)用（一）凝膠柱層析的操作特點(diǎn)1、凝膠柱層析優(yōu)點(diǎn)：（1）分離條件溫和，因此不易引起生物樣品的變性失活；（2）每次分離操作之后

11、，層析劑無需再生就可重復(fù)利用；（3）工作范圍廣，分離的分子質(zhì)量范圍可從幾百到數(shù)百萬；（4）設(shè)備簡(jiǎn)單，分離機(jī)理簡(jiǎn)單，易于操作；（5）樣品回收率高，幾乎可達(dá)100%。2、凝膠層析的缺點(diǎn)：凝膠層析上樣量小，操作壓力不能高，流速較慢。離子交換樹脂結(jié)構(gòu)骨架：接有功能基團(tuán)，本身是惰性v 離子交換法是通過帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離子進(jìn)行交換而達(dá)到分離純化的方法。離子交換層析原理1 陽離子交換樹脂2 陰離子交換樹脂 1強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂2 弱酸性陽樹脂v 功能團(tuán)可以為羧基-COOH，-OH (酚羥基）v 這類樹脂的電離程度小，其交換性能和溶液的pH有很大關(guān)系。在酸性溶液中，這類樹脂幾乎不能發(fā)生交

12、換反應(yīng)，交換能力隨溶液的pH增加而提高。3 強(qiáng)堿性陰樹脂4 弱堿性陰樹脂特殊類型的樹脂v 大網(wǎng)格離子交換樹脂v 兩性均孔樹脂v 蛇籠 樹脂v 均孔樹脂v 多糖交換樹脂離子交換樹脂命名 ×離子交換樹脂命名v 強(qiáng)酸性 （001-099）v 弱酸性（100-199）v 強(qiáng)堿性 （200-299)v 弱堿性 （300-399）v X 后面交聯(lián)度（對(duì)凝膠型離子交換樹脂）v 對(duì)大孔型離子交換樹脂，在型號(hào)的前面加¡°¡±表示。離子交換樹脂的理化性能對(duì)樹脂的一般要求：v （1）機(jī)械強(qiáng)度：膨脹度大，交聯(lián)度小的樹脂強(qiáng)度差v （2）化學(xué)穩(wěn)定性：主要指耐化學(xué)試劑、耐氧

13、化、耐輻射的性能。v （3）大小及形狀：制成球形，其直徑為。球形的優(yōu)點(diǎn)是增大比表面積、提高機(jī)械強(qiáng)度和減少流體阻力。v （4）色澤：普通凝膠型樹脂是透明的球珠，大孔樹脂呈不透明的霧狀球珠。隨合成原料、工藝條件不同，樹脂的顏色也有所不同，一般有黃、白、黃褐、紅棕等幾種顏色。 樹脂理化性能v （1）含水量v （2）膨脹度：v （3）膨脹率：v （4）濕真密度：v （5）交換容量；v （6）滴定曲線：離子交換操作方式v 靜態(tài)：操作簡(jiǎn)單、但是分批操作，交換不完全v 動(dòng)態(tài)：離子交換柱，交換、洗脫、再生等步驟均在柱內(nèi)進(jìn)行，亦稱為離子交換層析法, 操作連續(xù)、交換完全，適宜多組份分離 柱式固定床（FixedBe

14、d） 模擬移動(dòng)床（SMB）離子交換操作步驟v 1 樹脂的選擇v 2 樹脂預(yù)處理v 3 裝柱v 4 離子交換吸附v 5 洗脫v 6 再生2 樹脂預(yù)處理v 物理處理：水洗、過篩，去雜，以獲得粒度均勻的樹脂顆粒；v 化學(xué)處理：轉(zhuǎn)型 陽離子樹脂 酸堿酸 陰離子樹脂 堿酸堿 最后以去離子水或緩沖液平衡 3 離子交換吸附4 洗脫v 離子交換完成后，將樹脂吸附的物質(zhì)重新轉(zhuǎn)入溶液的方法 洗脫一般采取梯度淋洗：先采用洗脫能力弱的溶液，使易洗脫組分流出，然后依次使用洗脫能力更強(qiáng)的溶液，洗脫較難洗脫的組分。樹脂的再生特性與它的類型和結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。v 強(qiáng)酸/強(qiáng)堿樹脂再生比較困難，再生劑量比理論值高相當(dāng)多；v 弱酸/

15、弱堿性樹脂則較易再生，再生劑量只需稍多于理論值。v 大孔型和交聯(lián)度低的樹脂較易再生，而凝膠型和交聯(lián)度高的樹脂則要較長(zhǎng)的再生反應(yīng)時(shí)間。v 在實(shí)際運(yùn)用中，為降低再生費(fèi)用，使樹脂的性能恢復(fù)7080%。再生劑的種類應(yīng)根據(jù)樹脂的離子類型來選用，并適當(dāng)?shù)剡x擇價(jià)格較低的酸、堿或鹽。v 鈉型陽樹脂可用NaCl溶液再生，用量為其交換容量的2倍 ；v 氫型陽樹脂用強(qiáng)酸再生，鹽酸或硫酸v 氯型堿性樹脂，主要以NaCl  溶液來再生，但加入少量堿有助于將樹脂吸附的色素和有機(jī)物溶解洗出。v OH型堿陰樹脂則用4%NaOH溶液再生。腺苷蛋氨酸(SAM)的純化流程腺苷蛋氨酸(SAM)的純化流程第五節(jié) 親和層析(a

16、ffinity chromatography) 在固定相載體表面偶聯(lián)具有特殊親和作用的配基這些配基可以與流動(dòng)相中溶質(zhì)分子發(fā)生可逆的特異性結(jié)合而進(jìn)行分離的一種方法，稱之為親和層析親和柱層析 v 一、親和柱層析的原理v （一）配基固定化：選擇合適的配基與不溶性的支撐載體偶聯(lián)，或共價(jià)結(jié)合成具有特異親和性的分離介質(zhì)；v （二）吸附樣品：親和吸附介質(zhì)選擇性吸附酶或其他生物活性物質(zhì)，雜質(zhì)與層析介質(zhì)間沒有親和作用，故不能被吸附而被洗滌去除；v （三）樣品解析：選擇適宜的條件，使被吸附的親和介質(zhì)上的酶或其他生物活性物質(zhì)解吸二、親和吸附介質(zhì)v 用于親和層析的理想載體常選用均一的珠狀顆粒，特別是瓊脂糖和交聯(lián)葡聚糖

17、，但也使用合成的聚丙烯酰胺凝膠、纖維素衍生物、聚苯乙烯和多孔玻璃珠等。v 選作配基的分子必須具有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)，該基團(tuán)不參與配基與生物分子的特異結(jié)合，但是卻可以用來連接配基與載體。v 將親和配基共價(jià)偶聯(lián)在載體的表面，即可制得親和吸附介質(zhì)。一般凝膠過濾介質(zhì)均可作為親和配基的載體來制備親和吸附介質(zhì)。 三、親和柱層析的操作與應(yīng)用v （一）親和柱層析的操作特點(diǎn)v 1基本過程v （1）進(jìn)料吸附v （2）雜質(zhì)清洗v （3）目標(biāo)產(chǎn)物洗脫v （4）層析柱再生（二）親和層析的特點(diǎn)與應(yīng)用v 1、親和層析的特點(diǎn)：在生物制品分離和分析領(lǐng)域有寬廣的應(yīng)用開發(fā)前景。由于其具有簡(jiǎn)便、快速、專一和高效等特點(diǎn)，親和層析的應(yīng)用十分

18、廣泛，已普及到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。v 2、親和層析親和層析的應(yīng)用： v （1）分離和純化各種生物分子v （2）分離純化各種功能細(xì)胞v （3）用于各種生化成分的分析檢測(cè)第六節(jié) 疏水層析(hydrophobic chromatography) 利用固定相載體上偶聯(lián)的疏水性配基與流動(dòng)相中的一些疏水分子發(fā)生可逆性結(jié)合而進(jìn)行分離的方法，稱之為疏水層析。第六節(jié) 疏水柱層析 一、疏水層析的原理v 親水性蛋白質(zhì)（酶）表面均含有一定量的疏水性基團(tuán)。盡管在水溶液中蛋白質(zhì)（酶）具有將疏水性基團(tuán)折疊在分子內(nèi)部而表面顯露極性和荷電基團(tuán)的趨勢(shì)，但總會(huì)有一些疏水性基團(tuán)或極性基團(tuán)的疏水部位暴露在蛋白質(zhì)（酶）表面。這部分疏水基

19、團(tuán)可與親水性固定相表面偶聯(lián)的短鏈烷基、苯基等弱疏水基會(huì)發(fā)生疏水性相互作用，被固定相（疏水性吸附劑）所吸附。 二、疏水性吸附劑三、疏水柱層析的操作與應(yīng)用（一）疏水柱層析的操作特點(diǎn)v 1、層析柱的制備v 2、平衡v 3、加樣與洗脫v 4、再生（二）疏水柱層析的特點(diǎn)與應(yīng)用v 1、疏水柱層析特點(diǎn)：（1）疏水柱層析可直接分離鹽析后或高鹽洗脫下來的蛋白質(zhì)、酶等生物大分子溶液；（2）分辨率很高、流速快、加樣量大；（3）疏水性吸附劑種類多，選擇余地大，價(jià)格與離子交換劑相當(dāng)。v 2、疏水柱層析應(yīng)用：疏水柱層析適用于分離的任何階段，尤其是樣品離子強(qiáng)度高時(shí)，即在鹽析、離子交換或親和層析之后用。疏水柱層析主要用于蛋白

20、質(zhì)類生物大分子分離純化。第八節(jié) 分配柱層析 一、分配柱層析的基本原理v 分配柱層析是利用被分離物質(zhì)中各成分在兩種不相混溶的液體之間的分配系數(shù)不同而使混合物得到分離。v 固定在柱內(nèi)的液體叫固定相，用作沖洗的液體叫流動(dòng)相。為了使固定相固定在柱內(nèi)，需要有一種固體來吸牢它，這種固體本身不起什么分離作用，也沒有吸附能力，只是用來使固定相停留在柱內(nèi)，這種固體叫載體。v 進(jìn)行分離時(shí)先將含有固定相的載體裝在柱內(nèi)，加少量被分離的溶液后，用適當(dāng)溶劑進(jìn)行洗脫。在洗脫過程中，流動(dòng)相與固定相發(fā)生接觸，由于樣品中各成分在兩相之間的分布不同，因此向下移動(dòng)的速度不同，容易溶于流動(dòng)相中的成分移動(dòng)快，而在固定相中溶解度大的成分移

21、動(dòng)就慢，因此得到分離。 二、分配柱層析的載體（一）硅膠 吸水量為50%時(shí)仍為粉末狀，當(dāng)其吸水量在17%以上時(shí)，硅膠就失去其吸附作用，作為載體使用，此時(shí)硅膠層析則為分配層析。 （二）硅藻土 具有微孔結(jié)構(gòu)，不具吸附作用，是現(xiàn)在使用最多的載體。其處理和裝柱方法基本同硅膠相似 。（三）纖維素三、分配柱層析的固定相與展開劑（一）固定相 常用的固定相有水、各種緩沖溶液、酸的水溶液、甲酰胺、丙二醇以及為水所飽和的有機(jī)溶劑等。有時(shí)也采用¡°反相層析法¡±，即用有機(jī)溶劑為固定相，而以水或水溶液或與水混合的有機(jī)溶劑為流動(dòng)相。 （二）展開劑 流動(dòng)相一般用為水所飽和的有機(jī)溶劑或

22、水一有機(jī)溶劑互溶的混合液，一般常用的流動(dòng)相溶劑有石油醚、醇類、酮類、酯類、鹵代烷類、苯類等，或它們的混合物。反相層析法常用的流動(dòng)相，則為正相層析法中的固定相，如水、各種水溶液（包括酸、堿、鹽與緩沖液）、低級(jí)醇類等。 三、分配柱層析的基本操作（一）裝柱 裝柱前，將固定相與載體混合，如果用硅膠、纖維素等載體時(shí)，可以直加固定相直接混合，用硅藻土為載體先把硅藻土放在大量流動(dòng)相液體中，在不斷攪拌下，逐漸加入固定相。 （二）加樣v 1、將被分離物配成濃溶液，用吸管輕輕沿管壁加到含固定相載體的上端，然后加流動(dòng)相洗脫；v 2、被分離物溶液用少量含固定相的載體吸收，溶劑揮發(fā)后，加在層析管載體的上端，然后加流動(dòng)相

23、洗脫；v 3、用一塊比管徑略小的圓形濾紙吸附被分離物溶液，溶劑揮發(fā)后，放在載體上，然后加流動(dòng)相洗脫。四、分配柱層析的特點(diǎn)與應(yīng)用v （一）特點(diǎn)：v 分配柱層析具有載體來源容易、分離成本低、流速快等特點(diǎn),適用于分離極性比較大、在有機(jī)溶劑中溶解度小的成分，或極性很相似的成分。v （二）應(yīng)用：v 分配柱層析多用于分離親水性的成分，如苷類、糖及氨基酸類。 實(shí)驗(yàn)十 胡蘿卜素的柱層析分離 一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 v （一）實(shí)驗(yàn)原理及目的v 1、原理v 本實(shí)驗(yàn)采用氧化鋁為固定相的吸附層析。各種物質(zhì)具有不同的吸附力，v 胡蘿卜素存在于胡蘿卜、辣椒等黃綠色植物中，由于在動(dòng)物體內(nèi)可將胡蘿卜素轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素A，故又稱維生素A原。

24、胡蘿卜素（屬多烯色素類，又可分為、等幾種類型）可用乙醇、石油醚和丙酮等有機(jī)溶劑從食物中提取出來，并能被氧化鋁所吸附。由于胡蘿卜素與其他植物色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，它們?cè)谟袡C(jī)溶劑中的溶解度以及被氧化鋁吸附的強(qiáng)度也不相同，故將抽提液進(jìn)行氧化鋁柱層析，再用石油醚等沖洗層析柱，即可將植物提取液中混合的胡蘿卜素分離成不同的色帶。同植物其他色素相比較，胡蘿卜素的極性最小，吸附最差，用石油醚洗脫速度最快，故被最先洗脫下來，使胡蘿卜素與其他色素分開。同時(shí)也可將胡蘿卜素層析帶洗脫下來進(jìn)行比色定量。 v 2、目的 （1）了解柱層析的基本原理 （2）掌握胡蘿卜素分離的操作方法v （二）試劑及器具 1、材料 新鮮紅辣椒、

25、氧化鋁（Al2O3，高溫烘烤除去水分，提高其吸附力） 2、試劑 95%乙醇、無水硫酸鈉、石油醚（沸點(diǎn)6090）、1%丙酮-石油醚液（丙酮：石油醚=1：1；體積比）、三氯化銻氯仿溶液（稱取三氯化銻22g，加100ml氯仿溶解后，貯于棕色瓶中）。 3、器具 剪刀、研缽，層析柱（1cm×16cm）,100ml分液漏斗，量筒100ml，鐵架臺(tái)及蝶形夾，蒸發(fā)皿，恒溫水浴，天平，燒杯、軟木塞、棉花、膠頭滴管、濾紙、試管 二、實(shí)驗(yàn)過程 乙醇 石油醚 蒸餾水 硫酸鈉紅辣椒 研磨 研磨 洗滌 提取液 除水 上樣 層析 收集洗脫液 鑒別 三、注意事項(xiàng) v （一）實(shí)驗(yàn)中一定要將新鮮紅辣椒研細(xì)，以徹底破壞植

26、物細(xì)胞，使胡蘿卜素釋放更完全。丙酮可增強(qiáng)分離效果，有利于對(duì)胡蘿卜素的提取，若分離條件控制得好，可依次提取、分離得到胡蘿卜素，ß胡蘿卜素、胡蘿卜素，以及緊隨其后的是辣椒紅素，番茄紅素及葉黃素等植物色素。v （二）為使分離色帶整齊，裝柱時(shí)層析柱一定要無裂縫和氣泡，氧化鋁的高度一般為玻璃柱高度的3/4，裝好柱后柱上面覆一層濾紙，以保持柱上端頂部平整，若上端不平，影響分離效果而產(chǎn)生不規(guī)則的條帶。v （三）分離洗脫過程中，要連續(xù)不斷加入洗脫液，并保持一定高度的液面，在整個(gè)操作中絕不能使氧化鋁表面的液體流干。v （四）三氯化銻腐蝕性較強(qiáng)，在實(shí)驗(yàn)過程中切勿觸及皮膚。三氯化銻遇水生成堿式鹽，再轉(zhuǎn)變成

27、氯氧化銻，此化合物與胡蘿卜素不發(fā)生顏色反應(yīng)，而出現(xiàn)渾濁。v （五）石油醚提取液中的乙醇必須洗凈，否則吸附不好，層析中色帶也彌散不清。v （六）層析柱底部棉花的用量不宜過多，松緊要適宜，否則將影響流速。實(shí)驗(yàn)十一 離子交換色譜分離混合氨基酸一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 v （一）實(shí)驗(yàn)原理及目的v 1、原理 本實(shí)驗(yàn)采用磺酸型陽離子交換樹脂分離酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI=2.97，分子量為133.1）和堿性氨基酸賴氨酸（Lys，pI=9.74，分子量為146.2）的混合液。在pH=5.3條件下，因?yàn)閜H值低于Lys的pI值，Lys可解離成陽離子結(jié)合在樹脂上；Asp可解離成陰離子，不被樹脂吸附而流出層析柱。在pH

28、=12條件下，因pH值高于Lys的pI值，Lys可解離成陰離子從樹脂上被交換下來。這樣，通過改變洗脫液的pH值可使它們被分別洗脫而達(dá)到分離的目的。v 2、目的 (1)、了解離子交換樹脂分離氨基酸基本原理 (2)、掌握陽離子交換樹脂處理技 v （二）試劑及器具 1、材料 磺酸型陽離子交換樹脂（732型） 2、試劑 樹脂處理液：2mol/LNaOH、2mol/L HCL、1mol/L HCL、1mol/L NaOH、0.45mol/L檸檬酸緩沖液（pH=5.3）、0.01mol/LNaOH緩沖液（pH=12）、天冬氨酸、賴氨酸、茚三酮、無水乙醇。 3、器具 離子交換色譜柱、量筒、吸管、收集器、試管

29、、恒流泵。 二、實(shí)驗(yàn)過程 樹脂處理、轉(zhuǎn)型 裝柱 平衡 上樣 洗脫 收集 測(cè)定 三、注意事項(xiàng) v （一）為使分離色帶整齊，裝柱時(shí)層析柱一定要無裂縫和氣泡。v （二）分離洗脫過程中，要連續(xù)不斷加入洗脫液，并保持一定高度的液面，在整個(gè)操作中絕不能使樹脂表面的液體流干。v （三）一直保持流速10滴/min12滴/ min，并注意勿使樹脂表面干燥。 實(shí)驗(yàn)十二 凝膠柱層析分離蛋白質(zhì) 一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 v （一）實(shí)驗(yàn)原理及目的v 1、原理：v 凝膠層析（gel chromatography）是利用某些凝膠對(duì)于不同組分因分子大小不同而阻滯作用不同的差異而進(jìn)行分離的技術(shù)。當(dāng)溶液在層析柱內(nèi)流過時(shí)，各種物質(zhì)分子在柱內(nèi)同時(shí)進(jìn)行向下的移動(dòng)和不定向的分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。大分子物質(zhì)由于分子直徑大，難于進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，只能