TNF介紹講解學(xué)習(xí)

1、1、 TNF的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展歷史目前普遍認(rèn)為，TNF最早是1975年由Carswell發(fā)現(xiàn)的。Carswell在研究中觀察到，經(jīng)卡介苗致敏的小鼠被注射大腸桿菌內(nèi)毒素后，血清中出現(xiàn)一種物質(zhì)，該物質(zhì)在體內(nèi)可以使移植腫瘤發(fā)生出血、壞死，遂將該物質(zhì)命名為腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor,TNF）1。其實早在十九世紀(jì)后期，Coley等就觀察到，當(dāng)腫瘤患者伴有感染時，其腫瘤偶爾可以消退甚至痊愈?；谶@些發(fā)現(xiàn)，Coley等開始用一些滅活的G+和G-細(xì)菌混合物作為疫苗，來治療惡性月中瘤，稱為“Coley毒素”療法2。Coley毒素的應(yīng)用，大大提高了軟組織腫瘤患者的生存率，這在當(dāng)時獲得了較高的評

2、價。1936年，隨著Coley的去世，人們對Coley菌苗的興趣被廣泛應(yīng)用的化療和放療所取代。100多年后的今天，當(dāng)人們再次關(guān)注“Coley毒素”療法的時候，發(fā)現(xiàn)該療法的主要原理之一就是通過誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生大量的TNF來實現(xiàn)抗腫瘤作用的3。自Carswell發(fā)現(xiàn)TNF后，許多學(xué)者進(jìn)行的其他研究均觀察到TNF在體外和體內(nèi)對多種月中瘤細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒作用。1984年P(guān)ennica等首次克隆了人TNF-a的cDNA,并在大腸桿菌中表達(dá)成功4o隨后，即有許多學(xué)者致力于將TNF應(yīng)用于臨床的研究5。自1987年起，在歐洲（德國、英國、法國、波蘭、埃及等）、美國、日本等地陸續(xù)有進(jìn)行TNFI期和II期臨床試驗的

3、報道6。但臨床試驗的結(jié)果給對TNF滿懷希望的人們帶來的是失望。TNF類似嚴(yán)重感染所致的不良反應(yīng)令患者難以耐受，而患者可以耐受的劑量似乎達(dá)不到抗腫瘤的濃度7。一時間TNF的臨床研究陷入了低谷，進(jìn)一步的臨床研究幾乎停滯。由于TNF明確的抗腫瘤活性，使得不少學(xué)者不愿輕易放棄對其的研究。90年代中期以來，陸續(xù)有臨床研究者報道了TNF局部用藥的臨床結(jié)果8。證明TNF局部用藥（大劑量局部灌流、腫瘤內(nèi)注射、腔內(nèi)注射等）既可達(dá)到良好的抗腫瘤效果，又可避免全身用藥的嚴(yán)重副作用，這一發(fā)現(xiàn)重新燃起了人們對TNF的熱情。隨著對TNF結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制的深入研究，一些高效、低毒的TNF變構(gòu)體不斷涌現(xiàn)，TNF的臨床研究又有了

4、新的進(jìn)展。2、 TNF的生物學(xué)活性TNF是一種真正的多效因子，具有多種生物學(xué)效應(yīng)。它可直接作用于T細(xì)胞、B細(xì)胞、Md、NK細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞，在細(xì)胞水平上發(fā)揮作用。1. 與受體結(jié)合，引起細(xì)胞破壞、死亡TNF與相應(yīng)的受體結(jié)合后可向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，被靶細(xì)胞溶酶體攝取導(dǎo)致溶酶體穩(wěn)定性降低，各種酶外泄，引起細(xì)胞溶解9。也有認(rèn)為TNF通過激活磷脂酶A2,釋放超氧化物而引起DNA斷裂10。TNF尚可改變靶細(xì)胞糖代謝，使細(xì)胞內(nèi)pH降低，導(dǎo)致細(xì)胞死亡11。2. 損傷內(nèi)皮細(xì)胞，激活凝血系統(tǒng)TNF可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，使內(nèi)皮細(xì)胞損傷或?qū)е卵芄δ芪蓙y12；通過激活凝血系統(tǒng)的活性，導(dǎo)致血管內(nèi)血栓形成，引起組織供血障礙13。

5、3. 引起機(jī)體發(fā)熱TNF作為內(nèi)源性致熱原，引起發(fā)熱的機(jī)制可能是通過直接刺激下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞和刺激巨噬細(xì)胞釋放IL-1而引起，還可通過IL-1、TNF-a刺激其它細(xì)胞產(chǎn)生IL-614。4. 促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能TNF促進(jìn)T細(xì)胞MHCI類抗原表達(dá)，增強(qiáng)IL-2依賴的胸月M細(xì)胞、T細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)IL-2、CSF和IFN-丫等淋巴因子產(chǎn)生，增強(qiáng)有絲分裂原或外來抗原刺激B細(xì)胞的增殖和Ig分泌15；它能促進(jìn)T細(xì)胞及其它殺傷細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷，并增強(qiáng)CTL對病毒感染細(xì)胞的殺傷作用16。5. 抑制新骨生成、刺激骨吸收TNF在體外可刺激骨質(zhì)破壞和再吸收，抑制新骨形成17。將重組TNF加

6、入體外骨培養(yǎng)物可使多核的破骨細(xì)胞數(shù)增加，礦化的骨質(zhì)質(zhì)量下降，骨膠原(骨質(zhì)的主要成分)合成抑制。TNF刺激骨吸收是通過誘導(dǎo)成骨細(xì)胞產(chǎn)生一種可溶性因子完成的18。6. 激活嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞嗜中性粒細(xì)胞是一種特殊的白細(xì)胞，它可提供第一道防線，吞噬或殺傷入侵的微生物。在急性炎癥反應(yīng)階段，它抗擊入侵微生物的同時，也可使宿主組織發(fā)生損傷。TNF-a刺激嗜中性粒細(xì)胞可引起噬菌作用、脫顆粒作用和呼吸爆發(fā)活動的增加19。TNF可提高中性粒細(xì)胞的吞噬能力，增加過氧化物陰離子產(chǎn)生。同時TNF-a可提高中性粒細(xì)胞合成PAF的作用并可促進(jìn)中性粒細(xì)胞粘附到內(nèi)皮細(xì)胞上20。TNF-a也可促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的活化，加速I

7、L-2受體的表達(dá)2103、 TNF抗腫瘤作用的機(jī)制TNF最明顯的活性特征是可以在體內(nèi)或體外特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，而對正常細(xì)胞無明顯的毒性作用，且抗腫瘤作用沒有明顯的種族特異性22。目前認(rèn)為TNF的抗腫瘤機(jī)制主要有以下幾個方面：1. 通過TNF受體介導(dǎo)的對腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用對TNF敏感的腫瘤細(xì)胞表面存在TNF受體(TNFR)，TNF通過與該受體結(jié)合，引發(fā)細(xì)胞的一系列變化，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡。研究發(fā)現(xiàn)，TNF經(jīng)過TNFR的識別、結(jié)合、內(nèi)吞，導(dǎo)致一系列的變化，膜蛋白特異性磷酸化，產(chǎn)生大量熱能，溶酶體酶類高度活化，膜通透性增加，蛋白酶類溢出，導(dǎo)致細(xì)胞溶解；也有證據(jù)表明，TNF與受體結(jié)合后可使細(xì)胞

8、的線粒體產(chǎn)生的自由基增加，使質(zhì)膜過氧化，引起細(xì)胞損傷23。2. 抑制細(xì)胞生長和誘導(dǎo)凋亡。TNF與受體結(jié)合后，可通過細(xì)胞內(nèi)的一系列級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。TNF直接抑制細(xì)胞生長的作用也通過腫瘤細(xì)胞表面的特異性受體介導(dǎo)24。主要通過影響其蛋白質(zhì)的代謝，導(dǎo)致腫瘤蛋白質(zhì)合成減少，分解增加，從而抑制腫瘤生長25。3. 通過損傷腫瘤的血供系統(tǒng)而導(dǎo)致腫瘤的壞死月中瘤的血液供應(yīng)豐富，對血液供應(yīng)所減少較為敏感。TNF-a除了對月中瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用之外，更重要是它能摧毀實體瘤周圍的血管上皮組織，并且通過血栓的形成，阻斷腫瘤的血液營養(yǎng)供應(yīng)，最終導(dǎo)致腫瘤的出血性壞死、消退和消失26。另外，一般腫瘤周圍血管組

9、織是沒有規(guī)則和不完善的，它們表現(xiàn)為血管的多曲折性和多結(jié)性等。而且有些實體瘤本身發(fā)生就是缺氧下選擇性克隆產(chǎn)生的，遠(yuǎn)離血管，因此化療藥物很難預(yù)期達(dá)到這些腫瘤周圍并發(fā)揮作用27，而TNF-a能明顯降低實體瘤周圍間隙組織的壓力，擴(kuò)大月中瘤周圍上皮組織的間隙，并改變腫瘤周圍血管的通透性，使聯(lián)用的化療藥物到達(dá)這些靶組織周圍,而且TNF-a能延長藥物在月中瘤周圍的持續(xù)時間，發(fā)揮抗月中瘤作用28oTNF還可有促凝作用，可引起腫瘤部位血管內(nèi)的血栓形成，從而阻斷腫瘤的血液供應(yīng)。超過一定濃度的TNF-a具有明顯的抗新生血管形成作用。有報道顯示TNF-a對形成不超過9天的新生血管組織抑制作用更強(qiáng)烈29。有新的實驗證據(jù)

10、顯示30,TNF-a聯(lián)合其他藥物能在分子水平上明顯抑制整合素（integrin）av03的活性（這種整合素在腫瘤的新血管形成中起重要作用），進(jìn)而在動物模型中引發(fā)腫瘤血管上皮細(xì)胞的解體和凋亡，而這種作用不傷害周圍正常血管上皮組織。這個實驗為TNF-a有選擇性的抑制月中瘤血管上皮組織的作用提供了分子基礎(chǔ)。4. 通過引起腫瘤局部的炎癥反應(yīng)和機(jī)體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用TNF-a是一種細(xì)胞因子，它對人體免疫系統(tǒng)具有很重要的調(diào)節(jié)作用31o例如，TNF-a對免疫細(xì)胞樹突狀細(xì)胞具有催熟作用，具有激活和刺激T細(xì)胞作用32 oTNF-a可導(dǎo)致月中瘤局部的炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的殺傷作用，增

11、強(qiáng)T細(xì)胞的增殖和殺傷作用，還可誘導(dǎo)產(chǎn)生其他細(xì)胞因子如IL-2、IFN等，通過“級聯(lián)作用”發(fā)揮更強(qiáng)的殺月中瘤活性。另外，TNF-a通過對核內(nèi)基因的調(diào)控，促進(jìn)腫瘤抑制基因P53的表達(dá)33，從而加強(qiáng)機(jī)體自身的抗腫瘤作用34。5. 逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥，增加對化療藥物的敏感性TNF可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥，增加對化療藥物的敏感性，因而與化療藥物有較好的協(xié)同作用。用對阿霉素耐藥的K562細(xì)胞株進(jìn)行研究的結(jié)果顯示，TNF-a可使K562細(xì)胞的耐藥性有明顯的逆轉(zhuǎn)34。局部灌流治療時觀察到，TNF可使美法倫在腫瘤局部的濃度提高，從而提高美法倫的抗腫瘤活性35?？傊?，TNF在整體的抗腫瘤機(jī)制較為復(fù)雜，目前仍

12、有未完全清楚的地方。但普遍的觀點認(rèn)為，除了直接的對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用外，機(jī)體的免疫狀況、腫瘤的特性等均在其中起著較為重要的作用。四、TNF-a誘導(dǎo)的針對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用的途徑和機(jī)制TNF-a對月中瘤細(xì)胞直接的細(xì)胞毒作用主要是通過TNF特異性的受體完成的360細(xì)胞膜上的TNF-a受體是跨膜蛋白，其N端位于胞外，C端位于胞內(nèi)。受體有兩種亞型37，即TNFR1和TNFR2。這兩類受體蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量分別為55kDa和75kDa,故又將其稱為P55R（即TNFRi）和P75R（即TNFR2）。兩種受體在細(xì)胞類型的分布上沒有特異性38。這兩種受體的胞外部分有部分的同源性，但是在胞內(nèi)部分幾乎沒有

13、同源性39。TNFR1介導(dǎo)了TNF的主要生物活性反應(yīng)，在細(xì)胞損傷、誘導(dǎo)SOD及抗病毒活性、成纖維細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、激活NK-kB等多種生物活性的信號傳遞方面起重要的作用；而TNFR2主要傳遞胸腺細(xì)胞和NK細(xì)胞等的淋巴細(xì)胞的增殖信號40圖1.顯示了TNFRi與受體結(jié)合后所引發(fā)的一系列細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)及反應(yīng)0005DOSTNFRi的C端含有一段由90個氨基酸組成的死亡結(jié)構(gòu)域(deathdomain,DD)。TNF-a信號的起始是TNF-a三聚體與TNFRi的胞外部分結(jié)合。TNFRi的胞內(nèi)部分在非活性狀態(tài)下它的死亡結(jié)構(gòu)域上結(jié)合了一種被稱SODD(silencerofdeathdomai。的蛋白質(zhì)

14、，起到抑制TNFRi三聚體化的作用。當(dāng)TNF-a與TNFRi結(jié)合后，SODD就從TNFRi的死亡結(jié)構(gòu)域上釋放出來，通過細(xì)胞中的一系列接頭蛋白(adaptorprotein)來實現(xiàn)TNFRi的活性。第一個連接上去的接頭蛋白是TNF-a受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(TNFreceptor-associateddeathdomain,TRADD)。它通過自身的死亡結(jié)構(gòu)域與TNF-aRi的死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合4i。TRADD隨后又活化另外三個接頭蛋白：FADD(Fas-associateddeathdomain),TRAF2(TNF-Rassociatedfactor2及RIP(receptor-interact

15、ingprotein)結(jié)合，后者又各自匯集起始不同信號途徑的蛋白，產(chǎn)生不同的效應(yīng)42。TNFRi與TNF結(jié)合后的信號傳導(dǎo)主要有以下幾個途徑。1.FADDcaspase-腌徑FADD43的C端含有死亡結(jié)構(gòu)域，N端含有一段起調(diào)節(jié)作用的功能區(qū)，是介導(dǎo)凋亡信號傳導(dǎo)所必需的，稱為死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(deatheffectordomain，DED)44。當(dāng)TRADD結(jié)合到TNFR1后，F(xiàn)ADD通過自身的死亡結(jié)構(gòu)域與TNFR1-TRADD結(jié)合，激活了FADD。細(xì)胞內(nèi)caspase-M體中的死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域與FADD的死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而使caspase-81F體寡聚化，caspasesl一種存在于細(xì)胞質(zhì)中的和

16、細(xì)胞凋亡有關(guān)的蛋白酶45o寡聚化的caspase-M體發(fā)生自剪接作用產(chǎn)生有活性的caspase-8后者又激活caspase-3fficaspase-7接下去caspase-雙激活caspase-6如此啟動caspase勺級聯(lián)反應(yīng)，最后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。2 .TRAF2JNK途徑第二個接頭蛋白是TRAF2。TRAF2又激活MAPKKK(mitogen-activatedproteinkinasekinasekinase)，即MEKK(1extracellularsignal-regulatedkinasekinasekinasei)或ASKi(apoptosis-stimulatedkinasei)

17、。MEKK1或ASKi又激活MKK7或JNKK246，后者又激活JNK。一旦JNK被激活，JNK蛋白就進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，磷酸化激活c-Jun,增進(jìn)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。3 .TRAF2NF-kB途徑TRAF2還激活NIK(NF-kBinducingkinase),NIK又去激活I(lǐng)KKs47。IKK復(fù)合體包含兩個催化亞單位IKKa、IKKB和一個調(diào)控亞單位IKK丫/NEMO(NF-kBessentialmodulator')48,還包含一個由Cdc37和Hsp90組成的激酶特異性分子伴侶。它們負(fù)責(zé)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜之間運輸這個復(fù)合體49。沒有活性的核內(nèi)調(diào)控因子NF-kB是存在在

18、細(xì)胞質(zhì)中的50。TNF-a處理幾分鐘后，IKK被激活，IKK丫使NF-kB上的抑制因子IkB基團(tuán)磷酸化51。磷酸化的IrB又發(fā)生多泛素化(polyubiquitinated)并迅速被蛋白酶體(proteasomR降解，因此活化的NF-kB分子量變小，進(jìn)而能穿過核膜進(jìn)入核內(nèi)調(diào)控各種基因52o其結(jié)果是抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)炎癥反應(yīng)以及各種免疫反應(yīng)53。4 .TRAF2cIAPs途徑TRAF2可以匯集抑制細(xì)胞凋亡的蛋白cIAP-i和cIAP-2(cellularinhibitorofapoptosisprotein-1/-2）54。cIAP-1和cIAP-2是存在在細(xì)胞質(zhì)中的抗凋亡蛋白，有泛素蛋白連接酶

19、活性，可抑制細(xì)胞的凋亡。5 .RIPNF-kB途徑結(jié)合在TRADD上的第三種接頭蛋白是RIP（receptor-interactingprotein）。它主要通過IKK復(fù)合體來誘導(dǎo)NF-kB途徑。基因剔除實驗證明：TNF-a受體1是主導(dǎo)的受體反應(yīng)55;而TNF-a受體2則活化一種接頭蛋白TRAF2的反應(yīng)56。近期的研究還發(fā)現(xiàn)，一條途徑的減弱會增強(qiáng)另一條途徑的效應(yīng)叼。例如：缺少NF-kB活性時，細(xì)胞對TNF-a誘導(dǎo)的凋亡敏感性增加58,同樣nf-kB活性增強(qiáng)，細(xì)胞就不容易發(fā)生凋亡59。另外，缺少NF-kB時，細(xì)胞由TNF-a誘導(dǎo)的JNK活性會增強(qiáng)60,而由NF-kB激活的幾個基因產(chǎn)物（gadd4

20、5B和XIAP）則會抑制JNK活性61。而且，NF-kB的激活促進(jìn)屋B和其它抑制細(xì)胞凋亡的因子（cIAPs）的重新合成62,從而增加了對TNF-a信號調(diào)控的持續(xù)性63。五、野生型TNF-a和TNF-a變構(gòu)體的結(jié)構(gòu)體內(nèi)有多種細(xì)胞可釋放具有TNF活性的細(xì)胞因子，人們把由活化的巨噬細(xì)胞釋放的TNF,命名為TNF-a,而將源于淋巴細(xì)胞，具有TNF樣抗月中瘤作用的淋巴毒素稱為TNF-B64,新近又將自然殺傷細(xì)胞NK產(chǎn)生的NK細(xì)胞因子稱為TNF-T65。成熟的人TNF-a蛋白由157個氨基酸殘基組成，3個相同的TNF-a單體亞單位以邊對面的形式形成三聚體結(jié)構(gòu)。圖2.為TNF-a的結(jié)構(gòu)示意圖。由于野生型的T

21、NF-a在臨床試用后出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的毒性作用，曾使TNF全身用藥的臨床試驗陷入停頓。但TNF-a明確的殺傷月中瘤細(xì)胞的活性使得科研人員不愿輕易放棄對其的研究。除了不斷探索其不同的給藥途徑外，人們試圖通過對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，以期獲得高效低毒的TNF變構(gòu)體。八十年代中期，研究人員用“隨機(jī)突變法”和“定位突變法”把TNF-a的157個氨基酸上的每一段，甚至每一個氨基酸通過缺失和更換的手段來檢測它對TNF-a功能的影響66。TNF-a是由17KD的多肽，它的活性狀態(tài)是三聚體52KD的形式，三聚體間溝是由近N端和C端的極性基團(tuán)及中部的疏水基團(tuán)所組成的，而這些亞單位之間的溝是TNF-a與其受體結(jié)合的部位67

22、?？偟膩碇v，完整的C端對保持TNF的生物學(xué)活性是必需的，缺失任何一個氨基酸都會對TNF-a的抗腫瘤活性造成損害68。但是，C末端的的最后一個氨基酸Leu157改變成Phamet或者Glu,都能使其活性有較大的提高，有證據(jù)顯示這種改變使疏水性的TNF-a亞基之間的結(jié)構(gòu)變得更緊湊，從而提高了TNF-a同受體結(jié)合的效率69。與此相反，N端的氨基酸的丟失對TNF-a活性的影響不大，而且丟失1-7個N端的氨基酸，增加了其堿性度，提高了TNF-a和受體的親和度，使TNF-a的活性增加70。不僅如此，N端的8、9、10和17個氨基酸變成堿性氨基酸，使某些對野生型TNF-a不敏感的月中瘤細(xì)胞變得敏感了，擴(kuò)大了

23、TNF-a的療效范圍，而且還增強(qiáng)了其抗月中瘤的活性°。這些結(jié)果給研究和開發(fā)更高效、低毒的TNF變構(gòu)體提供了空問。自90年代初，不斷有學(xué)者對野生型TNF進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造的報道，他們利用減少N-端的氨基酸數(shù)、將一些氨基酸殘基進(jìn)行置換等方法，陸續(xù)獲得了一些較野生型TNF與受體結(jié)合能力更強(qiáng)、抗月中瘤活性更高、且毒副作用更小的新型TNF變構(gòu)體72（如突變體471、M3、F4616、TNF-B等），使得TNF的臨床應(yīng)用價值重新引起重視。六、新型重組人TNF-民的藥理活性特點目前我們公司生產(chǎn)的新型人TNF-a突變體與天然人TNF-a比較，N末端缺失了7個氨基酸的編碼序列，天然人TNF基因中編碼為Pro

24、8Sei9Asp10的編碼序列由ArgLysArg的編碼取代，157位的Leu被Phe取代。實驗證明，這樣經(jīng)過改造后的TNF-a變構(gòu)體，較野生型的TNF-a與受體的親和力更強(qiáng)，因而明顯提高了其抗月中瘤的療效，擴(kuò)大了應(yīng)用范圍；同時新型TNF的毒副作用較野生型明顯減輕，提高了月中瘤患者全身用藥的耐受性。圖2.為TNF-a的示意圖，黃色部分為突變部分。圖2.1 .細(xì)胞水平上的抗腫瘤活性用L-M細(xì)胞作為試驗對象，比較471突變體和野生型TNF-a的抗月中瘤活性73。結(jié)果顯示，471突變體比野生型TNF-a能更有效的殺死L-M細(xì)胞，其有效活性分別為2.00X07U/mg和3.03106U/mg。2 .受

25、體結(jié)合活性表1.總結(jié)了471突變體和野生型TNF-a的受體結(jié)合活性74。每個L-M細(xì)胞表面471突變體和野生型TNF-a的受體數(shù)量都為5000個左右，沒有明顯的差異，這說明471突變體和野生型TNF-a結(jié)合于同一受體上。兩者的Kd值分別為4.08109M和1.65109M。因而，突變體與受體的結(jié)合活性比野生型TNF-a要表1.野生型和突變體471對L-M細(xì)胞的作用TNF受體數(shù)量Kd值（M）野生型TNF_35.04X103一_-91.65X10突變體4715.06X103-94.08X1093 .體內(nèi)抗腫瘤活性將MethA-HM細(xì)胞移植BALB/c小鼠體內(nèi)（5X105i.d.注入側(cè)腹壁）進(jìn)行47

26、1突變體和野生型TNF-a的抗癌月中瘤活性檢驗75。當(dāng)月中瘤長到直徑為68mm時（0天）i.v.給藥（用PBS溶解50仙g的471突變體或野生型TNF-a）。隨后，在2、6、8、10天繼續(xù)給同樣劑量的TNF-a,實驗中對照小鼠只給PBS。結(jié)果顯示，同樣劑量的471突變體比野生型TNF-a有更好月中瘤抑制效果。由471突變體引發(fā)的平均壞死反應(yīng)是+,而野生型的是+。采用471突變體處理的小鼠與對照小鼠相比生存時間明顯延長，但用野生型TNF-a處理的小鼠生存時間則沒有明顯延長。471突變體處理組的5只小鼠中有2只在15天月中瘤完全消退76o4 .急性毒性采用B-D-半乳糖胺-激活的C3H/Hej鼠來

27、檢測471突變體和野生型TNF-a的急性致死毒性"。表2.顯示了兩類TNF-a不同劑量的作用結(jié)果。野生型TNF-a以濃度為16pg/k給藥后，小鼠出現(xiàn)100%致死率。但同樣劑量的471突變體只有20%致死率。471突變體和野生型TNF-a的LD50值分別為35仙g/kg和2仙g/kg由此可見，471突變體的致死毒性比野生型的要低很多表2.TNF的急性毒性試驗死亡率（死亡數(shù)/總數(shù)）TNFg/kg141664128356TNF0/55/55/55/55/55/5突變體4710/50/51/54/54/55/5總之，無論是采用體外殺傷細(xì)胞實驗還是采用動物體內(nèi)生長抑制及壞死反應(yīng)來比較471突

28、變體和野生型TNF-a的抗月中瘤活性，均顯示471突變體的抗月中瘤活性比野生型TNF-a要高。受體結(jié)合實驗結(jié)果也表明，471突變體較高的對月中瘤細(xì)胞的殺傷毒性可能由于它是有高的受體結(jié)合活性。整體動物研究中，還觀察到了一些小鼠月中瘤的完全消退。另一方面，471突變體比野生型TNF-a有較低的LD50,因此471突變體比野生型TNF-a更有效且毒性更低。七、TNF抗腫瘤作用的臨床研究概況自TNF發(fā)現(xiàn)以來，其抗月中瘤效果一直是得到公認(rèn)的。自從1984年TNF的cDNA克隆成功，很多研究者就將其基因工程產(chǎn)品試用于臨床。但I(xiàn)期和R期臨床研究的結(jié)果頗為令人失望，全身用藥帶來的嚴(yán)重的毒性反應(yīng)讓臨床研究一度陷

29、入停滯。八十年代末，著名的Eggerment78和Lejeune為首的兩個臨床研究小組分別對不能手術(shù)切除的HIV級軟組織肉瘤病人和轉(zhuǎn)移性黑色瘤病人，用TNF-a聯(lián)合抗月中瘤藥物美法倫或者丫-干擾素，進(jìn)行隔離性肢體灌流法治療。治療效果達(dá)到了（CR+PR）90%和70%。如此滿意的效果在月中瘤生物治療史上是前罕見的82。于是，人們重新開始審視原先對TNF的認(rèn)識。在1999年第35屆美國臨床月中瘤年會上專家們達(dá)成共識80:（1）TNF-a被重新確認(rèn)，肯定它對月中瘤治療具有明顯的療效。（2）TNF-a是具有潛力的抗月中瘤藥物，今后對TNF-a的研究和治療應(yīng)給予更多支持。同時，歐洲藥物審評委員會（EME

30、A）亦重新登記和接納了TNF-a作為抗月中瘤藥物81。另外，美國的FDA批準(zhǔn)了美國國立月中瘤研究院（NCI）牽頭的TNF-a治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的田期臨床研究方案83oTNF作為抗月中瘤藥的臨床研究進(jìn)入了柳暗花明的新階段。1. 局部用藥的臨床研究大量的臨床研究結(jié)果表明，TNF單獨或配合其他抗腫瘤藥，用于腫瘤的局部給藥，可在腫瘤局部獲得較高的TNF濃度，達(dá)到較好的治療效果，而不出現(xiàn)全身大劑量用藥所引起的嚴(yán)重不良反應(yīng)。（1）直接瘤內(nèi)注射有報道對各種類型癌癥病人，將TNF直接注入腫瘤局部緩解率可達(dá)4084。國內(nèi)解放軍第88醫(yī)院完成了B超引導(dǎo)下局部注射TNF治療肝癌30例臨床研究85，取得了良好的效果。

31、（2）腔內(nèi)注射胸、腹腔內(nèi)注射對于惡性胸腹水的治療有較好的療效86;膀胱內(nèi)灌注，治療膀胱癌也可見明顯療效87；心包腔內(nèi)注射治療惡性心包積液88，可獲得CR40.0%（8/20）,PR40.0%（8/20）的療效。（3）隔離肢體灌流LejuneF89和Eggermont90率先將TNF用于肢體灌流，治療肢體軟組織肉瘤和骨腫瘤，其療效高達(dá)到90和70，替代了截肢，提高了病人的生活質(zhì)量91。另有報道，TNF與美法侖聯(lián)合應(yīng)用隔離肢體灌注治療肢體黑色素瘤和軟組織肉瘤，有效率高達(dá)70-10092。在高溫隔離灌注化療的同時加用腫瘤壞死因子，可提高對肢體腫瘤局部控制作用93明顯改善患者的生活質(zhì)量94。（4）隔離

32、肝臟灌注（isolatedhepaticperfusio，nIHP）有研究顯示，將肝臟血液循環(huán)與體循環(huán)系統(tǒng)隔離，利用心肺機(jī)進(jìn)行體外循環(huán)，將TNF-a聯(lián)合美法倫或阿霉素肝臟灌注，可取得較好的治療效果95o目前以TNF-a為主聯(lián)合用藥隔離肝臟灌注法（IHP）已進(jìn)入II期臨床研究。日本的NakamototT等應(yīng)用此法治療肝癌有效率已超過75%;應(yīng)用于轉(zhuǎn)移性肝臟月中瘤60例，有效率亦高達(dá)60%96。除了隔離灌流外，亦有應(yīng)用介入療法經(jīng)肝動脈插管，注入TNF治療肝臟腫瘤的研究報道97。除肝臟之外，隔離灌注法還可以用于肺98、腎99等器官，也取得了較為滿意的結(jié)果?？傊?，TNF的局部用藥，解決了全身用藥難以達(dá)

33、到有效濃度，或用藥量過大病人難以耐受的問題，使得腫瘤局部的TNF濃度和維持時間能達(dá)到有效抗腫瘤的效果，為腫瘤的治療提供了一條有效的途徑。2. TNF全身用藥的抗腫瘤效果由于TNF早期的臨床研究應(yīng)用的是野生型的TNF,因毒副作用較大而難以給予較大的劑量，故臨床效果并不如體外實驗和動物實驗的結(jié)果那么令人鼓舞。隨著基因工程技術(shù)的應(yīng)用，出現(xiàn)了多種高效低毒的突變體，這些突變體進(jìn)行臨床試驗的結(jié)果也不斷有所報道。（ 1） TNF單用于腫瘤的治療日本學(xué)者1001998年前將其研制出的TNF突變體TNF-SAM2用于治療結(jié)直腸癌肺轉(zhuǎn)移，得出結(jié)論：TNF-SAM2毒副作用輕，抗腫瘤治療效果明顯優(yōu)于TNF-a101

34、。我國于20世紀(jì)90年代下半葉起，即有不少關(guān)于TNF治療腫瘤的報道。文獻(xiàn)顯示，單用TNF治療晚期肺癌，可獲得42.6的有效率（PR+CR），若與化療藥物合用，則有效率可達(dá)77.2（PR+CR）102。單用TNF治療晚期腫瘤患者的惡性胸腹水，也有明顯的療效103。由于惡性腫瘤的治療多采用綜合療法，除少數(shù)晚期患者，經(jīng)各種治療方法無效時方采用TNF單獨治療，因此，全身性單用TNF治療腫瘤的報道不多，多數(shù)為與其他療法合用的報道。（ 2） TNF與其他抗腫瘤藥物合用大量國內(nèi)外臨床研究資料表明，TNF-a與許多化療藥物或細(xì)胞因子聯(lián)合使用，抗腫瘤作用增強(qiáng)。在局部用藥治療肢體軟組織肉瘤、黑色素瘤、骨腫瘤和肝癌

35、時，多以TNF-a為主，聯(lián)合應(yīng)用美法侖104及干擾素-丫105、阿霉素106等，可顯著提高療效。一般認(rèn)為其作用機(jī)理為：TNF-a摧毀了月中瘤周圍的血管上皮組織，使瘤體暴露在藥物的攻擊之下，瘤體周圍藥物濃度可增加3-6倍107。因而，抗癌效果明顯增強(qiáng)。其他學(xué)者108的研究也證明TNF-a同TGF-B、1干擾素、美法倫、阿霉素和各種抗炎藥物的聯(lián)合使用，有協(xié)同抗月中瘤作用。Inagawa等研究發(fā)現(xiàn)，TNF與烷化劑如環(huán)磷酰胺合用時，療效可提高4-5倍，認(rèn)為與改變了宿主的免疫狀態(tài)有關(guān)109。YamasaliK等對結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移患者使用內(nèi)源性和外源性TNF聯(lián)合其它抗癌藥物，如5-氟尿嘧啶（5-Fu）、絲裂霉

36、素C（MMC），療效提高，患者耐受性增強(qiáng)110。波蘭學(xué)者ChcialowskiA等進(jìn)行的I、II期臨床研究表明，TNF-a與其它細(xì)胞因子（如INF-丫、IL-2）及細(xì)胞增殖抑制藥物（如足葉乙花、環(huán)磷酰胺）有協(xié)同作用111。國內(nèi)這方面的研究報道也較多。如以新型腫瘤壞死因子與順鉑聯(lián)合腹腔灌注治療惡性腹腔積液112，聯(lián)合組有效率93.94（31/33）明顯高于單藥（順鉑）組的66.67（20/30），且聯(lián)合用藥未增加順鉑的副作用，而TNF副作用輕微。TNF與IL-2聯(lián)合應(yīng)用胸腔內(nèi)注射治療惡性胸水的臨床研究也顯示了兩者的協(xié)同作用113。本公司與第四軍醫(yī)大學(xué)生物技術(shù)中心聯(lián)合研制的新型重組人腫瘤壞死因子（

37、rmhTNF）,經(jīng)H、m期臨床試驗證實，rmhTNF聯(lián)合化療藥物在治療肺癌、消化道癌、頭頸部癌、黑色素瘤等惡性腫瘤中，具有協(xié)同作用和化療增敏作用，能明顯提高臨床療效，改善患者的一般狀況和生活質(zhì)量，提高患者的抗病能力，減少化療中感染的發(fā)生率和抗生素的使用率。rmhTNF單用對放化療失敗，而又無其他治療方法的晚期惡性腫瘤亦有一定的療效。rmhTNF的毒副作用少，患者均能耐受。H、m期臨床試驗結(jié)果表明，rmhTNF臨床應(yīng)用安全、有效（資料待發(fā)表）。八、TNF的耐受性和藥代動力學(xué)研究1耐受性研究早期對野生型TNF的大量臨床研究顯示，人體對TNF的耐受性較差，其主要的毒副作用的表現(xiàn)與急性全身性感染的癥狀

38、很相似，其嚴(yán)重程度并非總是與用藥劑量相關(guān)，也未觀察到藥物積蓄作用114，且并不引起致死性器官功能障礙115。這主要是由于TNF本身的致炎作用的結(jié)果116。全身應(yīng)用（包括兒童117）的毒副作用主要為118：（1）心血管系統(tǒng)：低血壓、心律失常；（2）血液系統(tǒng)：中性粒細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白減少，停藥后恢復(fù)；（3）神經(jīng)系統(tǒng)：頭痛、發(fā)熱、寒顫、疲倦、嗜睡、感覺異常、骨肌肉疼痛、定向障礙、癲癇樣發(fā)作、行為異常；（4）消化系統(tǒng)：肝損傷：膽紅素、轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶升高，停藥后恢復(fù)；胃腸道：惡心、嘔吐、腹瀉、消化不良、胃出血；（5）泌尿系統(tǒng)：尿少、肌酐清除率下降；（6）呼吸系統(tǒng)：可出現(xiàn)致命的A

39、RDS癥狀、過敏樣支氣管痙攣；（7）皮膚系統(tǒng)：注射局部疼痛、紅腫、硬結(jié)、瘙癢、過敏反應(yīng)、脫發(fā)；（8）代謝系統(tǒng)：體重下降、甘油三酯升高。經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造后的TNF變構(gòu)體的上述毒副作用較野生型明顯減輕，臨床研究顯示119,月中瘤患者可接受靜脈注射的TNF衍生物rmhTNFaDa4X106IU/dX5d的劑量，其主要的毒性反應(yīng)為發(fā)熱、寒戰(zhàn)，其他的不良反應(yīng)如頭痛、惡心、嘔吐、血壓改變等均輕，無需特殊處理。我公司的rmhTNF亦有較好的耐受性。由于是肌肉注射給藥，月中瘤患者可接受400萬u/m2/dX7的劑量，主要的不良反應(yīng)為輕到中度的發(fā)熱、注射局部的疼痛、硬結(jié)，少數(shù)患者出現(xiàn)骨肌肉疼痛和感冒樣癥狀，這些不良

40、反應(yīng)均較輕，一般無需特殊處理，不影響繼續(xù)治療。（研究資料待發(fā)表）。2.藥代動力學(xué)研究（1）動物的藥代動力學(xué)研究小鼠靜脈給藥后，TNF在體內(nèi)的消除半衰期（ti/2）為0.51h120,肌肉注射的達(dá)峰時間（Tmax）為0.5h,在體內(nèi)的分布情況以腎臟最高，血液其次，其后為肺、肝，腦組織濃度最低121。小鼠注射TNF后主要經(jīng)腎臟排泄，24h尿放射性總回收率為87%122。恒河猴肌注rmhTNF后Tmax為1.7h,t1/2為1.42.4h,血液中的消除符合一室模型123。（2）人體的藥代動力學(xué)研究靜脈注射rhTNFaDa后，藥時曲線符合二室模型，T1/2B為1.53±0.34h,表觀分布容

41、積（Vd）為0.623L124。人體肌肉注射的藥代動力學(xué)研究仍在進(jìn)行中。九、TNF可用于臨床的給藥途徑1. 全身用藥一般認(rèn)為TNF殺傷月中瘤細(xì)胞需要724小時，而人體實驗表明TNF半衰期最常不超過2小時，因此要維持TNF的血漿濃度，必須持續(xù)靜滴才行125。但持續(xù)靜脈輸入TNF可導(dǎo)致較嚴(yán)重的不良反應(yīng)，病人難以耐受，且在治療過程中機(jī)體尚可產(chǎn)生抗TNF的抗體，從而影響了TNF的抗癌作用。目前已用于臨床試驗的全身給藥途徑有靜脈、肌肉和皮下給藥等。我們公司的TNF注射劑的給藥途徑為肌肉注射。由于從肌肉吸收入血有一個過程，血中TNF達(dá)到的峰值水平較靜脈給藥平緩，故可以一次注射較大劑量而避免出現(xiàn)靜脈給藥時的

42、嚴(yán)重不良反應(yīng)。2. 局部用藥局部用藥可以減少全身不良反應(yīng)，腫瘤細(xì)胞可以較長時間暴露于高濃度的TNF中，以增強(qiáng)TNF的作用。局部給藥方法有實體瘤內(nèi)注射，胸膜腔、腹膜腔內(nèi)注射，導(dǎo)管內(nèi)（灌注）給藥等，前面已有介紹。十、臨床上與TNF聯(lián)合用藥的治療方案每個月中瘤細(xì)胞表面有10002000個TNF結(jié)合位點，此位點的數(shù)目與月中瘤細(xì)胞的種類有關(guān)，也隨細(xì)胞周期發(fā)生變化，一般認(rèn)為在增值周期的G2-M期，受體的數(shù)目達(dá)峰值126。TNF治療腫瘤的療效與腫瘤細(xì)胞對其的敏感性(腫瘤細(xì)胞表面TNF受體的數(shù)量)以及TNF向腫瘤局部TNF的濃度有關(guān)。因此，設(shè)法增加腫瘤表面TNF受體的數(shù)量，以提高腫瘤的敏感性，和提高腫瘤局部T

43、NF濃度的方法，均可提高TNF的抗腫瘤療效。腫瘤局部給藥，如局部注射、局部血管內(nèi)灌流等給藥方法，可大大提高腫瘤局部的濃度，發(fā)揮較好的抗腫瘤效果，同時可減輕全身給藥時的副作用。TNF與其他抗腫瘤藥物合用，抑制蛋白質(zhì)合成，破壞腫瘤周圍的蛋白膜形成，可以有利于外源性TNF的滲入到月中瘤局部127;與其他細(xì)胞因子如yIFN、IL-1等合用，可以提高腫瘤細(xì)胞表面的TNF受體的含量，增加敏感性128。1. 與抗癌藥物聯(lián)合用藥體外實驗證實，rhTNF與順鉑或更生霉素聯(lián)合應(yīng)用有一定的協(xié)同抗癌作用，以rhTNF和更生霉素聯(lián)合應(yīng)用效果更好129。TNF與絲裂霉素聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生協(xié)同的細(xì)胞毒作用130，其機(jī)制可能是TN

44、F通過受體進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞停留在G2期，繼而在M期溶解；絲裂霉素也是作用于M期的藥物，故兩者可產(chǎn)生較好的協(xié)同作用TNF與抗癌藥物的協(xié)同作用可解釋為共同破壞腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝和細(xì)胞分裂，從而抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞131。此外，TNF本身可以逆轉(zhuǎn)腫瘤對化療藥物的耐藥性，提高化療藥物的療效132。2. 與其他細(xì)胞因子合用(1) TNF與丫-干擾素(IFN-丫)協(xié)同抗月中瘤作用通過不同白環(huán)節(jié)，IFN-丫可增加月中瘤細(xì)胞表面的TNF受體，協(xié)同抑制月中瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成；TNF作用于G2期或M期，IFN-丫作用于S期，兩種因子聯(lián)合應(yīng)用能協(xié)同增強(qiáng)抗腫瘤作用133。(2) TNF與白細(xì)胞介素-(IL-2)協(xié)同作用在TNF治療時，腫瘤周圍注射IL-2能明顯增加一些腫瘤對TNF的敏感性。有研究表明，使用TNF之前，IL-2只能增加毒性反應(yīng)而無抗腫瘤作用，但在TNF使用48小時后，IL-2與其產(chǎn)生協(xié)同作用，能明顯地抑制腫瘤生長134。有研究者發(fā)現(xiàn)無論體內(nèi)或體外，I