pcr擴(kuò)增的原理和步驟

1、pcr擴(kuò)增的原理和步驟聚合酶鏈反應(yīng)(CR)是分子生物學(xué)中的一種科學(xué)技術(shù)，將一段DNA的一個(gè)或幾個(gè)拷貝跨越幾個(gè)數(shù)量級(jí)，產(chǎn)生數(shù)千到數(shù)百萬(wàn)個(gè)特定DNA序列的拷貝。目前，PCR是一種常見(jiàn)的、經(jīng)常不可缺少的技術(shù)，用于醫(yī)學(xué)和生物研究實(shí)驗(yàn)室的各種應(yīng)用。PCR技術(shù)涉及三個(gè)主要步驟：變性、退火和擴(kuò)展。PCR技術(shù)有助于對(duì)越來(lái)越多的疾病進(jìn)行調(diào)查和診斷。定性PCR不僅可以檢測(cè)人類(lèi)基因，還可以檢測(cè)細(xì)菌和病毒的基因。PCR也被用于法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室，并且特別有用，因?yàn)橹恍枰倭康脑糄NA。PCR可以識(shí)別與癌癥發(fā)展有關(guān)的基因。分子克隆得益于PCR作為一種技術(shù)的出現(xiàn)?；靖拍頟CR基本原理簡(jiǎn)單。顧名思義，它是一個(gè)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：一個(gè)DN

2、A分子被用來(lái)產(chǎn)生兩個(gè)拷貝，然后是四個(gè)，然后是八個(gè)等等。這種連續(xù)的加倍是由特定的蛋白質(zhì)完成的，稱(chēng)為聚合酶，這種酶能夠?qū)蝹€(gè)DNA構(gòu)建塊串在一起形成長(zhǎng)分子鏈。要完成他們的工作聚合酶需要提供DNA構(gòu)建塊，即由腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞喀呢(C)和鳥(niǎo)喋吟(G)組成的核甘酸。他們還需要一個(gè)小的DNA片段，稱(chēng)為引物，他們將構(gòu)建塊以及一個(gè)較長(zhǎng)的DNA分子連接起來(lái)，作為構(gòu)建新鏈的模板。如果提供這三種成分，酶將構(gòu)建模板的精確副本。PCR是一種用于獲取任何特定核酸鏈的許多拷貝的方法。這是一種選擇性地?cái)U(kuò)增DNA特定片段的手段。該片段可能代表DNA大而復(fù)雜的混合物的一小部分。人類(lèi)基因的特定外顯子。它可以被認(rèn)為是

3、分子復(fù)印機(jī)。PCR可以在2小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增出可用數(shù)量的DNA(通過(guò)凝膠電泳可見(jiàn))。模板DNA不需要高度純化一個(gè)煮沸的細(xì)菌菌落?？捎孟拗菩?xún)?nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，測(cè)序或克隆。PCR可以擴(kuò)增單個(gè)DNA分子，例如，從一個(gè)精子聚合酶鏈反應(yīng)依賴(lài)于DNA復(fù)制酶在高溫下保持穩(wěn)定的能力。PCR已經(jīng)改變了幾乎所有需要操縱DNA片段的研究都可能由于其簡(jiǎn)單和有用而進(jìn)行的方式。在Mullis的原始PCR過(guò)程中，該酶被用于體外。將雙鏈DNA加熱至96C，分離成兩條單鏈DNA。然而，在這個(gè)溫度下，大腸桿菌DNA聚合酶被破壞，因此在每個(gè)循環(huán)的加熱階段后，酶必須補(bǔ)充新的新鮮酶。穆利斯最初的PCR過(guò)程非常低效，因?yàn)樗枰罅康臅r(shí)

4、間、大量的DNA聚合酶，以及整個(gè)PCR過(guò)程中的持續(xù)關(guān)注。PCR技術(shù)的步驟有三個(gè)主要步驟：變性、退火和擴(kuò)展。在第一步中，DNA在高溫下（從9097攝氏度）被變性。在第二步中，引物退火到DNA模板鏈上，以進(jìn)行主要擴(kuò)展。在步驟三中，延伸發(fā)生在退火引物的末端，以創(chuàng)建DNA的互補(bǔ)拷貝鏈。這有效地使DNA數(shù)量加倍，通過(guò)PCR周期的第三步。為了用PCR擴(kuò)增DNA片段，樣品首先加熱，使DNA變性，或分離成兩片單鏈DNA。接下來(lái)，一種名為“Ta廉合酶”的酶合成了兩條新的DNA鏈，使用原始鏈作為模板。這一過(guò)程導(dǎo)致原始DNA的復(fù)制，每個(gè)新分子都含有一條舊的和一條新的DNA鏈。然后這些鏈中的每一個(gè)都可以用來(lái)創(chuàng)建兩個(gè)新

5、的副本，以此類(lèi)推。退火相發(fā)生在較低的溫度，5060C。這使得引物能夠雜交到它們各自的互補(bǔ)模板鏈，這是法醫(yī)化學(xué)非常有用的工具。然后，新形成的DNA鏈的引物連接到模板，然后用于創(chuàng)建相同的副本，從原來(lái)的模板鏈所需的。Taq聚合酶在退火引物的末端添加可用核甘酸。引物的延伸由Taq聚合酶發(fā)生在大約72C下2-5分鐘。DNA聚合酶I不能被用來(lái)拉長(zhǎng)引物，因?yàn)樗赑CR所需的高溫下是不穩(wěn)定的。PCR周期和過(guò)程的優(yōu)點(diǎn)是與其他技術(shù)相比非常快，每個(gè)周期將所需DNA鏈的拷貝數(shù)加倍。經(jīng)過(guò)25-30個(gè)周期，無(wú)論誰(shuí)在DNA樣本上進(jìn)行PCR過(guò)程，都會(huì)有大量原始DNA樣本的副本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。假設(shè)每一步的最大時(shí)間，30個(gè)周期只需6小

6、時(shí)就能完成。隨著變性、退火和聚合酶延伸的過(guò)程繼續(xù)進(jìn)行，引物在新合成的鏈中反復(fù)與原始DNA模板和互補(bǔ)位點(diǎn)結(jié)合，并被擴(kuò)展以產(chǎn)生新的DNA拷貝。最終結(jié)果是DNA片段總數(shù)的指數(shù)增加，其中包括PCR引物之間的序列，這些序列最終以理論豐度為2n表示，其中n是循環(huán)數(shù)。由于引入了一種耐熱DNA聚合酶，TaqDNA聚合酶一次，在PCR反應(yīng)開(kāi)始時(shí)。從生長(zhǎng)在110多。C間歇泉中的Thermus水生植物（Taq）中分離出DNA聚合酶活性的熱穩(wěn)定性，對(duì)聚合酶鏈反應(yīng)的產(chǎn)率、特異性、自動(dòng)化和效用有很大的貢獻(xiàn)。Taq酶能夠承受重復(fù)加熱到94。Q因此每次混合物冷卻以允許寡核甘酸引物結(jié)合催化劑的延伸已經(jīng)存在。最后一個(gè)周期后，樣品

7、通常在72C下孵育5分鐘，以填充新合成的PCR產(chǎn)物的突出端。為了確保成功，應(yīng)注意制備反應(yīng)混合物和設(shè)置循環(huán)條件。將周期數(shù)增加到35以上幾乎沒(méi)有積極的作用，因?yàn)楫?dāng)試劑耗盡時(shí)，平臺(tái)發(fā)生積累。擴(kuò)增的特異性取決于引物在多大程度上能夠識(shí)別和結(jié)合預(yù)期的目標(biāo)DNA序列以外的序列。方法在分子生物學(xué)中，實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)，又稱(chēng)定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)，是一種基于PCR的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，用于擴(kuò)增和同時(shí)定量靶向DNA分子。傳統(tǒng)上，PCR是在一個(gè)管中進(jìn)行的，當(dāng)反應(yīng)完成時(shí)，通過(guò)凝膠電泳分析和可視化反應(yīng)的產(chǎn)物（擴(kuò)增的DNA片段）。然而，實(shí)時(shí)PCR允許分析產(chǎn)品，而反應(yīng)實(shí)際上正在進(jìn)行中。這是通過(guò)使用各種熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這些染料與放大的

8、產(chǎn)物反應(yīng)，并且可以用儀器測(cè)量。這也有利于DNA的定量。定量PCR（Q-PCR）,如這一技術(shù)已知，用于測(cè)量PCR產(chǎn)物的數(shù)量（通常在實(shí)時(shí)PCR過(guò)程中）。定量測(cè)定DNA、cDNA或RNA的起始量是首選方法。因此，PCR通常用于確定樣本中是否存在DNA序列以及樣本中其拷貝數(shù)。實(shí)時(shí)PCR的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)速度快，因?yàn)樵贒NA擴(kuò)增反應(yīng)后不需要進(jìn)行電泳或其他程序。數(shù)字PCR概念是由Sykes等人于1992年構(gòu)思的。它是對(duì)傳統(tǒng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的改進(jìn)，可用于直接定量和克隆擴(kuò)增核酸，包括DNA、cDNA或RNA。dPCR和傳統(tǒng)PCR的關(guān)鍵區(qū)別在于核酸量的測(cè)定方法，前者比PCR更精確。PCR每單個(gè)樣品進(jìn)行一次反應(yīng)。在樣品中，dPCR也進(jìn)行單個(gè)反應(yīng)，但樣品被分離成大量的分區(qū)，反應(yīng)是在每個(gè)分區(qū)中單獨(dú)進(jìn)行的。這種分離可以更可靠地收集和敏感地測(cè)量核酸的數(shù)量。反向PCR是聚合酶鏈反應(yīng)的一種變體，它只用一個(gè)已知序列來(lái)擴(kuò)增DNA。傳統(tǒng)PCR的一個(gè)限制是，它需要與靶DNA的兩個(gè)末端互補(bǔ)的引物，但這種方法允許進(jìn)行PCR,即使只有一個(gè)序列可供設(shè)計(jì)引