主管檢驗技師考試臨床免疫學和免疫檢驗講義第十五章免疫細胞功能檢測技術(shù)

1、資料收集丁網(wǎng)絡，如有侵權(quán)請聯(lián)系網(wǎng)站刪除第十五章免疫細胞功能檢測技術(shù)免疫細胞是指參與機體免疫應答的細胞，大致可分為兩類，一類能識別特異性抗原，一旦被激活則顯示出特異性應答的功能，主要指淋巴細胞群，包括T細胞、B細胞、NK細胞、K細胞等；另一類能捕獲抗原,處理抗原，以一定方式提呈給淋巴細胞或表現(xiàn)其他免疫功能，包括中性粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等。測定這些細胞功能可以有效評價機體特異性和非特異性免疫功能。第一節(jié)淋巴細胞的功能檢測淋巴細胞功能測定可分為體內(nèi)試驗和體外試驗。體內(nèi)試驗主要是進行退發(fā)型超敏反應，借此間接了解淋巴細胞對抗原、半抗原或有絲分裂原的應答反應；體外試驗主要包括淋巴細胞對抗原或有絲分

2、裂原刺激后的增殖反應、細胞毒性試驗及淋巴細胞分泌產(chǎn)物的測定。一、T細胞功能檢測T細胞具有多種免疫生物學功能，如直接殺傷靶細胞、輔助或抑制B細胞產(chǎn)生抗體，對特異性抗原或絲裂原刺激產(chǎn)生增殖反應及產(chǎn)生各種細胞因子。據(jù)此，建立了一系列檢測T細胞功能的體內(nèi)和體外試驗。（一）T細胞增殖試驗1. 原理：T細胞在體外受到有絲分裂原或抗原的刺激后，細胞增殖，并轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞。因此，淋巴細胞增殖反應又稱淋巴母細胞轉(zhuǎn)化。2. 刺激物：植物血凝素（PHA、刀豆素A（Con3和美洲商陸（PWM、白喉類毒素、破傷風類毒素、純化蛋白衍生物（PPD和白色念珠菌等。3. 方法學：檢測T細胞增殖反應的方法有：（1）形態(tài)學檢查法

3、：運用普通光學顯微鏡,簡便易行。缺點是依靠肉眼觀察形態(tài)學變化，判斷結(jié)果易受主觀因素影響，重復性和準確性較差。（2）3H-TdR摻入法：敏感性高，客觀性強，重復性好，但需一定設備條件，及存在放射性核素污染問題。（3）MTT比色法：本方法的敏感性雖不及3H-TdR摻入法，但操作簡便，無放射性污染。較常采用。（二）T細胞分泌功能測定體外培養(yǎng)的T細胞經(jīng)各種絲裂原或抗原刺激后，分泌各種細胞因子，可借助免疫學、細胞生物學及分子生物學技術(shù)通過對于T細胞分泌細胞因子的含量、生物學活性和基因表達水平，以反映T細胞功能。（三）T細胞介導的細胞毒試驗常選用可傳代的已建株的人腫瘤細胞，與待檢淋巴細胞混合，觀察腫瘤細胞

4、殺傷的情況。是評價機體細胞免疫水平的常用指標，特別是測定腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細胞的能力，常作為判斷預后和觀察療效的指標之一。（四）體內(nèi)實驗正常機體對某種特殊抗原建立了細胞免疫后，如用相同的抗原做皮膚試驗，常可出現(xiàn)陽性的退發(fā)型超敏反應。目前臨床上常用于診斷某些病原微生物感染（結(jié)核、麻風等）和細胞免疫缺陷等疾病，也常用于觀察細胞免疫功能在治療過程中的變化及判斷預后等。特異性抗原皮膚試驗：常用的特異性抗原皮膚試驗為結(jié)核菌素皮膚試驗。其他皮試抗原還有白色念珠菌素、皮膚毛癬菌素、腮腺炎病毒等。受試者對所試抗原過去的致敏情況直接影響試驗結(jié)果。若受試者從未接觸過該抗原，則不會出現(xiàn)陽性反應，因此陰性者也不一

5、定表明細胞免疫功能低下。為避免判斷錯誤，往往需用兩種以上抗原進行皮試，綜合判斷結(jié)果。PHA皮膚試驗：將定量PHA注射到受試者前臂皮內(nèi)，可非特異性刺激T細胞發(fā)生母細胞轉(zhuǎn)化，呈現(xiàn)以單個核細胞浸潤為主的炎性反應。PH觸膚試驗敏感性高，比較安全可靠，臨床常用于檢測機體的細胞免疫水平。二、B細胞功能檢測B細胞主要產(chǎn)生Ig參與機體體液免疫應答，B細胞功能低下或缺乏者對外源性抗原刺激的應答能力減弱或缺陷，特異性抗體產(chǎn)生減少或缺如。因此，B細胞功能試驗方法有受試者血清Ig含量檢測和體外B細胞增殖和產(chǎn)生抗體能力檢測等。（一）B細胞增殖試驗：原理與T細胞增殖試驗相同，但刺激物不同，小鼠B細胞可用細菌脂多糖（LPS

6、）作為刺激物，人則用含SPA的金黃色葡萄球菌菌體及抗IgM抗體等刺激。（二）溶血空斑試驗原理：將SRB說疫的小鼠脾臟（或家兔淋巴結(jié)）制成單個細胞懸液，與SRBCS瓊脂糖凝膠內(nèi)混合后傾注于小平皿或玻片上。脾細胞中的抗體生成細胞釋放抗SRBS體，使其周圍的SRBCM敏，在補體參與下可將SRBCB解，形成肉眼可見的溶血空斑。每一個空斑中央含一個抗體形成細胞，空斑數(shù)目即為抗體形成細胞數(shù)?？瞻叽笮”硎究贵w形成細胞產(chǎn)生抗體的多少。1. 方法學（1）經(jīng)典溶血空斑形成試驗：用于檢測實驗動物抗體形成細胞的功能?？煞譃橹苯臃ê烷g接法。直接法所測到的細胞為IgM類抗體形成細胞，其他類型的Ig由于溶血效應較低，不能直

7、接檢測；間接法，即在小鼠脾細胞和SRBC昆合時，再加抗鼠Ig抗體（如兔抗鼠Ig），使抗體產(chǎn)生細胞所產(chǎn)生的IgG或IgA與抗Ig抗體結(jié)合成復合物，此時能活化補體導致溶血。上述直接法和間接法都只能檢測抗RBCt體的產(chǎn)生細胞，而且需要事先免疫，難以檢測人類的抗體產(chǎn)生情況。（2）被動溶血空斑試驗：是指抗體形成細胞產(chǎn)生的Ig與SRBCk的抗原結(jié)合，在補體參與下出現(xiàn)溶血反應。方法是將吸附有已知抗原的SRBC待檢B細胞、補體及適量瓊脂糖液混合，傾注平皿，溫育13小時后，形成肉眼可見的溶血空斑。這種非紅細胞抗體性溶血空斑試驗可檢測SRBCk抗原相應的抗體形成細胞，因此應用范圍較廣2. 臨床應用與評價：溶血空斑

8、試驗主要用于測定藥物和手術(shù)等因素對體液免疫功能的影響，評價免疫治療或免疫重建后機體產(chǎn)生抗體的能力。（三）酶聯(lián)免疫斑點試驗（ELISPOT）1. 原理：用抗原包被固相載體，加入待檢的抗體產(chǎn)生細胞，即可誘導抗體的分泌。分泌的抗體與包被抗原結(jié)合，在抗體分泌細胞周圍形成抗原抗體復合物，使細胞吸附于載體上，加入酶標記的第二抗體與細胞上的抗體結(jié)合，通過底物顯色反應的深淺，可測定出生成的抗體量，并可在鏡下計數(shù)著色的斑點形成細胞。2. 應用與方法學評價該方法既可檢測抗體分泌細胞，又可檢測抗體分泌量。其優(yōu)點是穩(wěn)定、特異、抗原用量少；可同時檢測不同抗原誘導的不同抗體分泌，并可定量；可檢測組織切片中分泌抗體的單個細

9、胞。（四）體內(nèi)實驗B細胞功能減低或缺陷，可表現(xiàn)為體內(nèi)Ig和血型抗體量下降或缺如。常用于體內(nèi)抗體產(chǎn)生的特異性抗原有白喉類毒素、破傷風類毒素、多價肺炎鏈球菌菌苗等。將適量抗原皮下或肌內(nèi)注射免疫，并于免疫前及免疫后1、2、3周分別采血，分離血清、測定受檢者免疫前后相應抗體的效價,判斷受檢者體內(nèi)B細胞的功能。三、NK細胞活性測定NK細胞具有ADCC能直接殺傷腫瘤細胞，故將單個核細胞與腫瘤細胞共同培養(yǎng)，腫瘤細胞存活率低，NK細胞的活性則高。測定人NK細胞活性的靶細胞多用K562細胞株，而測定小鼠NK細胞活性則常采用YAC-1細胞株。僉測NK細胞活性的方法有形態(tài)學法、酶釋放法、放射性核素釋放法、化學發(fā)光法

10、、流式細胞術(shù)法第二節(jié)吞噬細胞功能檢測技術(shù)大吞噬細胞：包括血液中的大單核細胞及其進入各種組織后發(fā)育而成的巨噬細胞及樹突狀細胞等。功能：非特異性地吞噬殺滅病原體、衰老病殘和突變的細胞；在特異性免疫形成過程中，參與抗原識別和遞呈，生成多種細胞因子，參與退發(fā)型變態(tài)反應和多種自身免疫性疾病的病理損傷。小吞噬細胞：中性粒細胞。功能：以吞噬功能為主，發(fā)揮非特異性免疫防疫作用并參與機體的免疫應答炎癥損傷等。吞噬細胞的吞噬活動大體分為趨化、吞噬和胞內(nèi)殺滅作用三個階段，據(jù)此建立相應的檢測方法。一、中性粒細胞功能檢測（_）趨化功能檢測1. 原理：中性粒細胞在趨化因子如微生物的細胞成分及其代謝產(chǎn)物、補體活性片段（C5

11、a、C3a）、某些細胞因子等作用下產(chǎn)生趨化運動,其趨化運動強度可反映中性粒細胞的趨化功能。2. 方法學：（1）濾膜滲透法（Boyden小室法）；（2）瓊脂糖平板法。（二）吞噬和殺菌功能測定1. 顯微鏡檢查法：將白細胞與葡萄球菌或白色念珠菌懸液混合溫育，涂片,固定，堿性亞甲藍液染色。油鏡下計數(shù)吞噬細菌和未吞噬細菌的白細胞數(shù)。對有吞噬作用的白細胞，應同時記錄所吞噬的細菌數(shù)。2. 溶菌法：將白細胞懸液與經(jīng)新鮮人血清調(diào)理過的細菌（大腸桿菌或金黃色葡萄球菌）按一定比例混合，溫育。每隔一定時間取定量培養(yǎng)物，稀釋后接種固體平板培養(yǎng)基。37C培養(yǎng)18小時后，計數(shù)生長菌落數(shù)，以了解中性粒細胞的殺菌能力。3. 硝

12、基四氮喋藍還原試驗（NBT還原試驗）。二、巨噬細胞功能檢測人巨噬細胞一般從外周血或經(jīng)斑螯敷貼形成的皮泡液中獲取,也可從肺泡灌洗液或患者腹膜透析液中分離。實驗室研究中常用小鼠腹腔巨噬細胞。（一）炭粒廓清試驗（二）吞噬功能檢測巨噬細胞對顆粒性抗原物質(zhì)具有很強的吞噬功能,常用雞紅細胞（CRBC、白色念珠菌、酵母細胞等作為吞噬顆粒。將巨噬細胞與雞紅細胞懸液在體外混合,溫育,涂片，染色，油鏡下觀察、計數(shù)，通過計算吞噬率和吞噬指數(shù)來反映巨噬細胞的吞噬功能，并通過觀察雞紅細胞的消化程度，判斷巨噬細胞消化功（三）巨噬細胞溶酶體酶的測定巨噬細胞富含溶酶體酶，如酸性磷酸酶、非特異性酯酶和溶菌酶等，測定這些酶的活性

13、也是衡量巨噬細胞功能的指標之一。（四）細胞毒作用的測定（五）巨噬細胞促凝血活性測定第三節(jié)免疫細胞功能檢測的臨床應用免疫細胞功能檢測可以反映機體免疫功能狀態(tài)，同時還可用于腫瘤、免疫缺陷病等疾病的診斷和預后監(jiān)測。如免疫細胞的功能試驗可幫助免疫缺陷病的診斷;腫瘤患者的細胞免疫功能狀態(tài)監(jiān)測有助于了解腫瘤的發(fā)展與預后判斷；組織器官移植后對受者的細胞免疫學功能監(jiān)測則有利于排斥反應的早期發(fā)現(xiàn)，以便及時采取有效措施。用斑螯敷貼法可以從人體組織液中獲取較純的A. 巨噬細胞B. B細胞C. T細胞D. 粒細胞E. 漿細胞正確答案A答案解析人巨噬細胞一般從外周血或經(jīng)斑螯敷貼形成的皮泡液中獲取,也可從肺泡灌洗液或患者腹膜透析液中分離。檢測巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)常采用A. NBT還原試驗B. 殺菌試驗C. 斑螯發(fā)泡試驗D. 趨化試驗E. 雞紅細胞吞噬試驗正確答案E答案解析吞噬功能檢測：巨噬細胞對顆粒性抗原物質(zhì)具有很強的吞噬功能,常用雞紅細胞（CRBC、白色念珠菌、酵母細胞等作為吞噬顆粒。將巨噬細胞與雞紅細胞懸液在體外混合,溫育,涂片，染色，油鏡下觀察、計數(shù)，通過計算吞噬率和吞噬指數(shù)來反映巨噬