2022年單個(gè)核細(xì)胞分離-凍存及復(fù)蘇

1、1、 外周血單個(gè)核細(xì)胞Ficoll別離：向Ficoll分層液離心管中參加稀釋的血液樣本，1500rpm，5min離心機(jī)離心；i用毛細(xì)吸管輕輕插入灰白色層，沿管壁輕輕吸出該層的單個(gè)核細(xì)胞，盛入另一支離心管中，將所得的單個(gè)核細(xì)胞懸液用5倍體積的Hanks液或RPMI-1640洗滌2次，1500rpm，5min；用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞至所需濃度；淋巴細(xì)胞濃度濃度細(xì)胞數(shù)/mL=四個(gè)大方格內(nèi)細(xì)胞數(shù)/4×1042、 細(xì)胞凍存：1配制含10%DMSO或甘油、1020%小牛血清的凍存培養(yǎng)液； 2 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰蛋白酶把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來，懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞那么

2、直接將細(xì)胞移至15ml離心管中、； 3離心1000rpm，5min； 4去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，參加適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5×106/ml1×107/ml； 5 將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管11.5 ml； 6在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間及操作者； 7. 凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1-2/ min；當(dāng)溫度達(dá)-25以下時(shí)，可增至-5-10/min；到-100時(shí)，那么可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20冰箱2h ，然后放入-80冰箱中過夜，取

3、出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。 3、細(xì)胞復(fù)蘇： 1從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。 2從37水浴中取出凍存管，翻開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻； 3離心， 1000rpm，5min； 4棄去上清液，參加含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)； 5次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。4、考前須知：1從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，但最好為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液； 2將凍存管放

4、入液氮容器或從中取出時(shí)，要做好防護(hù)工作，以免凍傷； 3凍存和復(fù)蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。4細(xì)胞分層液應(yīng)避光4下保存，取出后逐漸升至室溫后混勻，方可使用，防止細(xì)菌污染。5稀釋血液可降低紅細(xì)胞的凝集，提高淋巴細(xì)胞售貨量，但是如果要保存血漿成分作為其他實(shí)驗(yàn)用時(shí)，那么不能稀釋血液，以免影響血漿成分。5、所需材料：1儀器：凈化工作臺(tái)、離心機(jī)、恒溫水浴箱、冰箱4、-20、-80、倒置相差顯微鏡、 培養(yǎng)箱、液氮冰箱 2玻璃器皿：吸管彎頭、直頭、培養(yǎng)瓶、玻璃瓶250ml、100ml、廢液缸 3塑料器皿： 吸頭、槍頭、膠塞、 移液管10ml、15ml離心管、 凍存管12ml 其他物品：微量加樣槍、 紅血球計(jì)數(shù)板、記號(hào)筆 、醫(yī)用橡皮膏、移液槍 5試劑:D-Hanks液、小牛血清、培養(yǎng)液、雙抗青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶0.08% 、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO分析純或無色新鮮甘油內(nèi)容總結(jié)1外周血單個(gè)核細(xì)胞Ficoll別離：向Ficoll分層液離心管中參加稀釋的血液樣本，1500rpm，5min離心機(jī)離心2外周血單個(gè)核細(xì)胞Ficoll別離：向Ficoll分層液離心管中參加