體外抗菌實驗-18

1、 第二十章第二十章 藥物的體外抗菌試驗藥物的體外抗菌試驗藥物的體外抗菌試驗藥物的體外抗菌試驗 藥物的體外抗菌試驗是在體外測定微藥物的體外抗菌試驗是在體外測定微生物對藥物敏感程度的試驗，生物對藥物敏感程度的試驗， 已廣泛地應用于科研、生產(chǎn)和臨床。如抗菌已廣泛地應用于科研、生產(chǎn)和臨床。如抗菌藥物的篩選、提取過程中的追蹤、抗菌譜的定、藥物的篩選、提取過程中的追蹤、抗菌譜的定、藥物含量的測定、藥物血濃度測定、指導臨床用藥物含量的測定、藥物血濃度測定、指導臨床用藥的藥敏試驗等。藥的藥敏試驗等?？咕囼灠ㄒ质a試驗和殺菌試驗?？咕囼灠ㄒ质a試驗和殺菌試驗。抑菌：抑菌：即抑制微生物的生長繁殖，但不能殺死微

2、即抑制微生物的生長繁殖，但不能殺死微 生物，在藥物除去后微生物又能生長生物，在藥物除去后微生物又能生長.殺菌：殺菌：即能殺死微即能殺死微 生物，當藥物除去后，微生生物，當藥物除去后，微生 物也不能再生長繁殖。物也不能再生長繁殖。 第一節(jié)第一節(jié) 常用的體外抑菌試驗常用的體外抑菌試驗連續(xù)稀釋法：連續(xù)稀釋法： 可用于測定藥物的最低抑菌濃度可用于測定藥物的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺和最低殺菌濃度菌濃度(MBC)?？梢杂靡后w培養(yǎng)基，也可用固體培。可以用液體培養(yǎng)基，也可用固體培養(yǎng)基。養(yǎng)基。1液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法 2固體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法固體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法 分平板法和斜面分平板法和斜

3、面 法。法。 瓊脂擴散法：瓊脂擴散法： 是利用藥物可以在瓊脂培養(yǎng)基中擴散，在藥是利用藥物可以在瓊脂培養(yǎng)基中擴散，在藥物有效濃度的范圍內(nèi)形成抑菌圈或抑菌距離，以物有效濃度的范圍內(nèi)形成抑菌圈或抑菌距離，以抑菌圈直徑或抑菌距離的大小來評價藥物抗菌作抑菌圈直徑或抑菌距離的大小來評價藥物抗菌作用強弱。用強弱。1、濾紙片法、濾紙片法 適用于新藥的初篩試驗。適用于新藥的初篩試驗。2打孔法打孔法 適于藥物血濃度的監(jiān)測。適于藥物血濃度的監(jiān)測。3挖溝法挖溝法 適用于在一個平板上試驗一種藥物對幾種試驗適用于在一個平板上試驗一種藥物對幾種試驗菌的抗菌作用。菌的抗菌作用。 第二節(jié)第二節(jié) 殺菌試驗殺菌試驗用以評價藥物對微

4、生物的致死活性。用以評價藥物對微生物的致死活性。最低殺菌濃度：最低殺菌濃度： 指該藥物能殺死細菌的最低濃度。從對微生指該藥物能殺死細菌的最低濃度。從對微生物廣義而言，也可稱之為最低致死濃度物廣義而言，也可稱之為最低致死濃度(MLC)。 是將待檢藥物先以合適的液體培養(yǎng)基在試管內(nèi)進行連續(xù)稀釋，每管內(nèi)再加入一定量的試驗菌液，培養(yǎng)后可得該藥物的MIC，取MIC終點以上未長菌的各管培養(yǎng)液，分別移種于另一無菌平板上，培養(yǎng)后凡平板上無菌生長的藥物最低濃度即為該藥物的MBC(或MLC)。 活菌計數(shù)法活菌計數(shù)法 是在一定濃度的定量藥物內(nèi)加入定量的試驗菌，是在一定濃度的定量藥物內(nèi)加入定量的試驗菌，作用一定時間后，

5、取樣進行活菌計數(shù)，從存活的微生作用一定時間后，取樣進行活菌計數(shù)，從存活的微生物數(shù)計算出藥物對微生物的致死率。物數(shù)計算出藥物對微生物的致死率。石炭酸系數(shù)（又稱酚系數(shù)）石炭酸系數(shù)（又稱酚系數(shù)） 是以石炭酸為標準，在規(guī)定的試驗條件下，作用是以石炭酸為標準，在規(guī)定的試驗條件下，作用一定時間，將待測的化學消毒劑與石炭酸對傷寒沙門一定時間，將待測的化學消毒劑與石炭酸對傷寒沙門菌或金黃色葡萄球菌的殺菌效力相比較，菌或金黃色葡萄球菌的殺菌效力相比較， 所得殺菌所得殺菌效力的比值。效力的比值。 棋盤格法棋盤格法 是由于在試驗時，含兩種不同濃度是由于在試驗時，含兩種不同濃度藥物的試管排列呈棋盤狀而得名，藥物的試管

6、排列呈棋盤狀而得名， 用以用以評價兩種藥物同時用不同濃度進行聯(lián)合評價兩種藥物同時用不同濃度進行聯(lián)合試驗時的抗菌活性。試驗時的抗菌活性。 第三節(jié)第三節(jié) 聯(lián)合抗菌試驗聯(lián)合抗菌試驗 在藥學上作中，常需檢查兩種抗菌藥物在藥學上作中，常需檢查兩種抗菌藥物在聯(lián)合應用時的相互作用以及抗菌藥物與不在聯(lián)合應用時的相互作用以及抗菌藥物與不同同pH值或不同離子溶液的相互影響。如加強值或不同離子溶液的相互影響。如加強藥物抗菌作用的為藥物抗菌作用的為協(xié)同協(xié)同(synergism)；減弱藥；減弱藥物作用的為物作用的為拮抗拮抗(antagonism)；相互無影響的；相互無影響的為為無關無關(indjfference)；作用

7、為二者之和的為；作用為二者之和的為累累加加(addition)。 紙條試驗紙條試驗 即在已接種試驗菌的平板表面垂直放置兩條各浸有即在已接種試驗菌的平板表面垂直放置兩條各浸有一種藥液的濾紙條，培養(yǎng)后根據(jù)抑菌區(qū)的加強、減弱或一種藥液的濾紙條，培養(yǎng)后根據(jù)抑菌區(qū)的加強、減弱或無影響來判斷它們在聯(lián)合應用時的效應。無影響來判斷它們在聯(lián)合應用時的效應。梯度平板紙條試驗梯度平板紙條試驗 需先制備含藥的梯度平板。將試驗菌懸液涂布于需先制備含藥的梯度平板。將試驗菌懸液涂布于平板表面，取濾紙條浸透另一待檢藥液，按梯度平板平板表面，取濾紙條浸透另一待檢藥液，按梯度平板中藥物濃度遞減的方向置于平板表面。培養(yǎng)后，如該中藥

8、物濃度遞減的方向置于平板表面。培養(yǎng)后，如該待檢藥液對平板內(nèi)的藥物有加強作用，則可見沿紙條待檢藥液對平板內(nèi)的藥物有加強作用，則可見沿紙條兩邊的抑菌區(qū)被擴大。兩邊的抑菌區(qū)被擴大。 第四節(jié)第四節(jié) 體外抗菌試驗的影響因素體外抗菌試驗的影響因素1試驗菌試驗菌 在抗菌試驗中所用試驗菌一般應該用標在抗菌試驗中所用試驗菌一般應該用標準菌株。準菌株。2培養(yǎng)基培養(yǎng)基 培養(yǎng)基的質量須加控制。培養(yǎng)基的質量須加控制。3抗菌藥物抗菌藥物 藥物的濃度和總量直接影響抗菌試驗的藥物的濃度和總量直接影響抗菌試驗的結果，需要精確配制。結果，需要精確配制。 第二十一章第二十一章藥物制劑的微生物學檢查藥物制劑的微生物學檢查 藥物制劑的

9、微生物學檢查藥物制劑的微生物學檢查 藥物制劑的微生物學檢查主要包藥物制劑的微生物學檢查主要包括無菌檢驗，細菌總數(shù)測定，霉菌總括無菌檢驗，細菌總數(shù)測定，霉菌總數(shù)測定，以及病原菌的檢驗與螨的檢數(shù)測定，以及病原菌的檢驗與螨的檢測等。測等。 第一節(jié)第一節(jié) 無菌制劑的無菌檢查無菌制劑的無菌檢查（一）一般藥品的無菌檢查（一）一般藥品的無菌檢查 一般藥品的無菌檢查法屬于直接接種法，即一般藥品的無菌檢查法屬于直接接種法，即將檢品按規(guī)定量直接分別接種于適宜需氧菌、厭將檢品按規(guī)定量直接分別接種于適宜需氧菌、厭氧菌和真菌生長繁殖的一定量的培養(yǎng)基中，同時氧菌和真菌生長繁殖的一定量的培養(yǎng)基中，同時以同樣的培養(yǎng)基作陽性對

10、照試驗。以同樣的培養(yǎng)基作陽性對照試驗。 我國藥典規(guī)定以金黃色葡萄球菌我國藥典規(guī)定以金黃色葡萄球菌CMCC(B) 26003、生袍梭狀芽胞桿菌、生袍梭狀芽胞桿菌CMCC(B)64941、白、白假絲酵母菌假絲酵母菌CMCC(F)98001作為需氧菌、厭氧作為需氧菌、厭氧菌和真菌的陽性對照菌株。菌和真菌的陽性對照菌株。 （二）特殊藥品的無菌檢查法（二）特殊藥品的無菌檢查法 如果陽性對照管不長菌，則必須進行特殊處如果陽性對照管不長菌，則必須進行特殊處理后方可按照一般藥品的無菌檢查法進行。理后方可按照一般藥品的無菌檢查法進行。1油類藥物的無菌檢查油類藥物的無菌檢查 一般油劑因與常規(guī)培養(yǎng)基不混溶，藥品中的

11、一般油劑因與常規(guī)培養(yǎng)基不混溶，藥品中的微生物不易生長，所以一般可采用吐溫培養(yǎng)基，微生物不易生長，所以一般可采用吐溫培養(yǎng)基，其余同一般藥品無菌檢查法。其余同一般藥品無菌檢查法。 2抗菌藥物或含防腐劑藥物的無菌檢查抗菌藥物或含防腐劑藥物的無菌檢查 如果被檢藥品具有抗菌作用，陽性對照管及試驗如果被檢藥品具有抗菌作用，陽性對照管及試驗管均可能不長菌。因此在進行無菌檢查前必須采用一管均可能不長菌。因此在進行無菌檢查前必須采用一些方法除去藥物本身的抗菌作用，然后再依上述方法些方法除去藥物本身的抗菌作用，然后再依上述方法進行無菌檢查。進行無菌檢查。(1)加入滅活劑加入滅活劑(2)微孔濾膜法微孔濾膜法(3)稀

12、釋法稀釋法(4)離心沉淀法離心沉淀法 第二節(jié)第二節(jié) 口服藥及外用藥物的微生物學檢查口服藥及外用藥物的微生物學檢查 目前對口服藥及外用藥物的微生物目前對口服藥及外用藥物的微生物學檢驗主要是微生物限量檢驗，即限制學檢驗主要是微生物限量檢驗，即限制口服藥及外用藥的微生物總數(shù)和限制病口服藥及外用藥的微生物總數(shù)和限制病原微生物種類的系列測定項目。原微生物種類的系列測定項目。 我國規(guī)定的項目有：我國規(guī)定的項目有： 細菌總數(shù)測定，霉菌總數(shù)測定。病原菌細菌總數(shù)測定，霉菌總數(shù)測定。病原菌(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門菌和破傷風梭菌菌、沙門菌和破傷風梭菌)的

13、檢驗和活螨的檢的檢驗和活螨的檢驗等。驗等。判斷合格與否的標準是：判斷合格與否的標準是： 口服藥及外用藥中微生物總量須低于規(guī)定口服藥及外用藥中微生物總量須低于規(guī)定限量外，并須在口服藥物每克或每毫升中不得限量外，并須在口服藥物每克或每毫升中不得含有大腸埃希菌、沙門菌；外用藥物每克或每含有大腸埃希菌、沙門菌；外用藥物每克或每毫升中不得含有銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球毫升中不得含有銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和破傷風梭菌，此外均不得檢出活螨。菌和破傷風梭菌，此外均不得檢出活螨。 細菌總數(shù)的測定細菌總數(shù)的測定: 是了解被檢藥品在單位重量或體積是了解被檢藥品在單位重量或體積(每克每克或每毫升或每毫升)內(nèi)所含

14、有的活菌數(shù)內(nèi)所含有的活菌數(shù)(實際是需氧菌實際是需氧菌的活菌數(shù)的活菌數(shù))，以判斷供試藥物被細菌污染的程，以判斷供試藥物被細菌污染的程度，是對該藥品整個生產(chǎn)過程的衛(wèi)生學總評度，是對該藥品整個生產(chǎn)過程的衛(wèi)生學總評價的一個重要依據(jù)。價的一個重要依據(jù)。 霉菌和酵母菌總數(shù)的測定：霉菌和酵母菌總數(shù)的測定： 是考察供試藥物中每克或每毫升所含是考察供試藥物中每克或每毫升所含的活霉菌和酵母菌的總數(shù)，以判明檢品被的活霉菌和酵母菌的總數(shù)，以判明檢品被真菌污染的程度。真菌污染的程度。 病原菌檢驗的原則病原菌檢驗的原則： 病原菌的形態(tài)和培養(yǎng)特征的觀察是鑒別的基病原菌的形態(tài)和培養(yǎng)特征的觀察是鑒別的基本要求，對生化反應、血清

15、學反應、動物毒力試本要求，對生化反應、血清學反應、動物毒力試驗等項目的要求因菌而異，各有其側重點驗等項目的要求因菌而異，各有其側重點。 一般的檢測程序為：一般的檢測程序為：藥物的準備或預處理藥物的準備或預處理增菌培養(yǎng)增菌培養(yǎng)分離培養(yǎng)分離培養(yǎng)純純培養(yǎng)培養(yǎng)染色鏡檢、生化試驗、血清學試驗、動物染色鏡檢、生化試驗、血清學試驗、動物試驗等試驗等結果判斷。結果判斷。 凡由檢品中檢出大腸埃希菌時，表明該藥品可能凡由檢品中檢出大腸埃希菌時，表明該藥品可能被糞便污染，患者服用后，有被糞便中可能存在的其被糞便污染，患者服用后，有被糞便中可能存在的其他腸道致病菌和寄生蟲卵等病原體感染的危險。因此，他腸道致病菌和寄生

16、蟲卵等病原體感染的危險。因此，口服藥品中不得檢出大腸埃希菌?？诜幤分胁坏脵z出大腸埃希菌。檢驗要點：檢驗要點：(1)形態(tài)：革蘭陰性短小無芽胞桿菌。形態(tài)：革蘭陰性短小無芽胞桿菌。(2)分離培養(yǎng)：在伊紅美蘭（分離培養(yǎng)：在伊紅美蘭（EMB)培養(yǎng)基上分解乳培養(yǎng)基上分解乳 糖，產(chǎn)生紫黑色、有金屬光澤的菌落。糖，產(chǎn)生紫黑色、有金屬光澤的菌落。 (3)生化反應：乳糖發(fā)酵試驗：產(chǎn)酸產(chǎn)氣或產(chǎn)酸不產(chǎn)生化反應：乳糖發(fā)酵試驗：產(chǎn)酸產(chǎn)氣或產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；氣；IMViC試驗：試驗：+-，注意與產(chǎn)氣桿菌相區(qū)別。，注意與產(chǎn)氣桿菌相區(qū)別。1、大腸埃希菌、大腸埃希菌 檢驗要點：檢驗要點：(1)形態(tài)：革蘭陰性短小桿菌。形態(tài)：革蘭陰性短

17、小桿菌。(2)分離培養(yǎng)：分離培養(yǎng)：SS瓊脂上，沙門菌不分解乳糖，產(chǎn)瓊脂上，沙門菌不分解乳糖，產(chǎn)生生H2S，菌落無色、透明或半透明，圓形，邊緣整，菌落無色、透明或半透明，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，菌落中心呈黑褐色。齊，表面光滑濕潤，菌落中心呈黑褐色。EMB平平板上菌落呈無色或粉紅色。二糖鐵培養(yǎng)基板上菌落呈無色或粉紅色。二糖鐵培養(yǎng)基TSl上分上分解葡萄糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不分解乳糖、蔗糖，有動力、解葡萄糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不分解乳糖、蔗糖，有動力、產(chǎn)生黑色沉淀。產(chǎn)生黑色沉淀。(3)生化反應：見表生化反應：見表21l。(4)血清學反應：用可疑菌作為抗原，沙門菌血清學反應：用可疑菌作為抗原，沙門菌AF組的多價

18、血清作為抗體進行玻片凝集反應，并以生組的多價血清作為抗體進行玻片凝集反應，并以生理鹽水做對照試驗。理鹽水做對照試驗。 2、沙門菌、沙門菌 3、銅綠假單胞菌、銅綠假單胞菌檢驗要點：檢驗要點：(1)形態(tài)：革蘭陰性短桿菌。形態(tài)：革蘭陰性短桿菌。(2)分離培養(yǎng)：在十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板上菌分離培養(yǎng)：在十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板上菌落扁平，無定形，濕潤，周邊擴散或略有蔓延，灰落扁平，無定形，濕潤，周邊擴散或略有蔓延，灰白色，培養(yǎng)基上擴散有水溶性綠色色素。白色，培養(yǎng)基上擴散有水溶性綠色色素。(3)生化反應：氧化酶試驗陽性，綠膿菌素試驗陽性，生化反應：氧化酶試驗陽性，綠膿菌素試驗陽性，可報告檢出銅綠假單

19、胞菌。如綠膿菌素陰性，必須可報告檢出銅綠假單胞菌。如綠膿菌素陰性，必須明膠液化試驗陽性，硝酸鹽還原試驗陽性，明膠液化試驗陽性，硝酸鹽還原試驗陽性，42生生長試驗陽性，才可報告被檢品檢出銅綠假單胞菌。長試驗陽性，才可報告被檢品檢出銅綠假單胞菌。 4、金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌檢驗要點：檢驗要點：(1)形態(tài)：革蘭陽性球菌，葡萄狀排列。形態(tài)：革蘭陽性球菌，葡萄狀排列。(2)分離培養(yǎng)及生化試驗：見表分離培養(yǎng)及生化試驗：見表21-3如分離培養(yǎng)的可疑菌甘露醇和血漿凝固酶如分離培養(yǎng)的可疑菌甘露醇和血漿凝固酶試驗均為陽性，則可判斷為檢出金黃色葡試驗均為陽性，則可判斷為檢出金黃色葡萄球菌。萄球菌。 5、破傷風梭菌、破傷風梭菌 檢驗要點：檢驗要點：(1)形態(tài)：革蘭陽性芽胞梭菌，菌體細長，帶芽胞的菌形態(tài)：革蘭陽性芽胞梭菌，菌體細長，帶芽胞的菌體呈鼓楷狀。有周鞭毛，能運動，不形成英膜。體呈鼓楷狀。有周鞭毛，能運動，不形成英膜。(2)分離培養(yǎng)：葡萄糖疤肉培養(yǎng)基中生長