虎杖白藜蘆醇的提取工藝及檢測方法的研究進(jìn)展

1、虎杖白藜蘆醇的提取工藝及檢測方法的研究進(jìn)展    【摘要】  介紹了虎杖中白藜蘆醇的提取以及檢測方法的研究進(jìn)展，為進(jìn)一步開發(fā)利用提供了依據(jù)。 【關(guān)鍵詞】  虎杖 白藜蘆醇 提取工藝 檢測方法Abstract:In this paper，the advances in the research of extraction technology and determination of resveratrol from Polygonum cuspidatum were introduced,which provided referenc

2、es for more exploitation in the future.Key words:polygonum cuspidatum;  Resveratrol;  Extraction technology;  Determination白藜蘆醇(3,4,5,-三羥基二苯乙烯；trans-resveratrol)是一種活性多酚物質(zhì)，在虎杖、葡萄、花生、毛穗藜蘆、毛脈酸模等植物中存在。白藜蘆醇被認(rèn)為是一種植物抗毒素，在植物受到病原性進(jìn)攻和環(huán)境惡化時產(chǎn)生的。其藥理作用為：抗菌、抗氧化、預(yù)防心臟病、抗癌、抗血小板凝聚、保護(hù)肝臟、雌激素作用、防輻射、免疫調(diào)節(jié)、抗艾

3、滋病活性等13。白藜蘆醇已被喻為繼紫杉醇之后又一新的綠色抗癌藥物，它在食品、醫(yī)藥等方面應(yīng)用也越來越廣。在日本，已將含白藜蘆醇植物提取物作為食品添加劑使用；在我國，也有將白藜蘆醇植物提取物制成降脂、美容、減肥和抗癌天然保健食品及膠囊4。本文回顧了近年來虎杖白藜蘆醇的提取工藝以及檢測方法的研究進(jìn)展。1  提取方法1.1  酶提取法虎杖中除了含有白藜蘆醇外，還含有白藜蘆醇苷、蒽醌類、二苯乙烯類、多糖、氨基酸等物質(zhì)，白藜蘆醇苷在一定的條件下可以通過酶解脫去葡萄糖基而轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，酶解可以通過加入生物酶或利用植物內(nèi)微生物進(jìn)行，采用酶法從虎杖中提取白藜蘆醇已有專利報道58，向海艷等9

4、用纖維素酶酶解后提取，虎杖中白藜蘆醇苷在纖維素酶作用下，轉(zhuǎn)化成白藜蘆醇，使白藜蘆醇得率大大提高。其白藜蘆醇得率比直接醇提法提高近5倍。但這些方法存在轉(zhuǎn)化率不高、成本較高、需時較長等不足。1.2  微波提取法李核等10用微波輔助萃取法，研究了溶劑類型及萃取時間和溫度、微波功率、虎杖顆粒大小和水分等主要操作參數(shù)對虎杖中白藜蘆醇產(chǎn)率的影響，得到最佳萃取條件為：甲醇和丙酮為最佳萃取劑，溫度80，時間15 min，微波功率800900W，虎杖顆粒大小為0.450.30 mm，水分含量為20%，白藜蘆醇的得率為0.55%。1.3  超聲波提取法劉樹興等11以虎杖為原料，比較了熱水浸提、

5、回流提取、超聲波提取、索式提取、常溫磁力攪拌5種方式的白藜蘆醇提取效果，結(jié)果見表1。表1  不同提取方法比較（略）由表1可知，超聲波提取法的提取效果最好，而且提取時間最短。劉樹興等12用超聲波提取虎杖中的白藜蘆醇和大黃素，確定了最佳的工藝條件：超聲波功率250W，pH 4.0，料液比120，溫度40，超聲波時間30 min，80%乙醇和80丙酮（11），白藜蘆醇的提取率分別為3.34。曾里等13用超聲波輔助提取虎杖中白藜蘆醇，探討超聲波的占空比的改變對白藜蘆醇含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)占空比較小的超聲波輔助提取有利于保持較高的白藜蘆醇相對含量。江曙等14采用了回流提取、CO2超臨界流體萃取

6、、超聲波提取方法對虎杖中的白藜蘆醇進(jìn)行提取研究，結(jié)果表明超聲波的提取效果最好。最佳提取條件為：15倍75乙醇超聲波浸提60 min，白藜蘆醇提取率達(dá)0.03 mg/g。該方法工藝簡單，可提高提取效率、縮短提取時間、低溫條件下以超聲波提取有效成分還有利于維持原藥中有效成分的性質(zhì)。1.4  堿溶酸沉提取法由于白藜蘆醇酚羥基較少，在水中溶解度較小，在一定條件下它可與某些無機(jī)堿、堿性鹽形成酚鹽而增加其在體系中溶解度。通過調(diào)節(jié)體系pH值，白藜蘆醇將重新沉淀出來，故可通過堿溶酸沉方法富集提取白藜蘆醇。蘇文強(qiáng)等15采用堿性水溶液提取、調(diào)節(jié)溶液pH沉降方法，從虎杖中提取白藜蘆醇，并考察堿的種類、用量

7、及酸的種類、用量對提取效果影響，確立白藜蘆醇堿溶酸沉最佳提取條件為：用NaOH調(diào)節(jié)提取溶劑的pH值為10，在恒速、均勻攪拌下，加熱煮沸1 h，濾液用1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH為3，放置沉淀，真空過濾。該法與有機(jī)溶劑提取法相比，具有工藝簡單易行，操作安全方便，成本低，選擇性強(qiáng)的特點(diǎn)。1.5  CO2超臨界萃取法周錦珂等16采用超臨界CO2萃取虎杖中的白藜蘆醇，獲得最佳的實(shí)驗(yàn)條件為：萃取溫度50，萃取壓力25 MPa，萃取時間90 min，萃取物中白藜蘆醇的含量高達(dá)33；曹庸等17采用超臨界CO2流體技術(shù)對虎杖中白藜蘆醇進(jìn)行萃取，獲得初步萃取條件：萃取釜壓力25 MPa，溫度50；解析

8、釜壓力5.7 MPa，溫度46，用無水乙醇及CY(自制)作為改性劑，同時用HPLC對萃取物進(jìn)行白藜蘆醇含量測定。超臨界二氧化碳具有性質(zhì)穩(wěn)定、不易燃、無毒、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，但有一定的局限性：它主要適用低極性物質(zhì)萃取，壓力溫度選擇也較小，在生產(chǎn)應(yīng)用上存在設(shè)備一次性投資大，維護(hù)費(fèi)用高18等不足。2  檢測分析2.1  HPLC周建軍等19采用色譜柱為EclipseXDBC8柱，流動相為乙腈-水，流速為1 ml/min，檢測波長為303nm。測出漢中地區(qū)虎杖中白藜蘆醇的含量；周春山等20選用自填裝ODS-C18色譜柱(200 mm×4.6 mm,5 m)，以甲醇-水(4

9、1:59)為流動相，流速為0.6 ml·min-1，紫外檢測波長為303 nm。白藜蘆醇在0.060.30 g范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。 朱鴻津21采用HPLC法測定虎杖中白藜蘆醇含量，其間以聚酰胺柱對樣品進(jìn)行預(yù)處理，獲得較好分離度和高回收率。測定條件:ODS-C18柱，流動相為甲醇-水(3565)，檢測波長為300nm。白藜蘆醇在0.420g范圍內(nèi)具良好的線性關(guān)系，曹庸等22采用色譜柱:島津Shim-park CLC-ODS(150 mm×4.6 mm,5 m)，以乙腈-水(體積比為4159)溶液為流動相，流速1.0 ml/min，檢測波長306 nm。在此條件下，樣品溶液

10、進(jìn)樣質(zhì)量濃度范圍在5001000 g/ml時，白藜蘆醇含量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。朱立賢等23測定虎杖中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量。色譜柱為LichrospherC18，流動相為甲醇-水-醋酸，梯度洗脫，流速0.3ml·min-1，柱溫30，檢測波長305 nm，線性范圍為：0.039 60.356 4 g。該法準(zhǔn)確、簡便，重現(xiàn)性好，適用于虎杖中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的定量分析。2.2  TLC周國海等24用薄層掃描分析測定虎杖白藜蘆醇含量:以硅膠G為薄層吸附劑，氯仿丙酮醋酸水(440.50.2)為展開劑，在紫外燈(365 nm)下觀察熒光斑點(diǎn)，在365nm處并進(jìn)行掃描測定

11、，并對虎杖莖、根、葉進(jìn)行了含量測定，虎杖鮮根莖中含量達(dá)0.548%。傅紅等25建立一種虎杖中白藜蘆醇的含量測定方法，以石油醚-醋酸丁酯-甲醇-冰醋酸(410.70.02)為展開劑，293 mm紫外光為掃描波長，測定其含量，該方法簡單易行，準(zhǔn)確度高和重現(xiàn)性良好，可用于虎杖的質(zhì)量控制。2.3  毛細(xì)管電泳法(CE)毛細(xì)管電泳法（CE）是一種分離分析技術(shù)，以其高效、高速、微量和低消耗等優(yōu)點(diǎn)在分析領(lǐng)域中有著重要的應(yīng)用和發(fā)展前景。陳憲等26采用毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測技術(shù)(CE-ECD)對白藜蘆醇及虎杖苷進(jìn)行分離檢測。采用柱端噴壁式安培檢測方式，在最佳分離條件下，2待測物在12 min以內(nèi)完全分

12、離。白藜蘆醇和虎杖苷分別在1.2×10-61.0×10-4mol/L與6.0×10-75.0×10-5mol/L濃度范圍內(nèi)與峰電流成良好的線性關(guān)系，檢測下限分別為1.6×10-7和2.3×10-7mol/L。將該體系用于中藥虎杖、中成藥護(hù)肝寧片及市售紅葡萄酒的分析和回收實(shí)驗(yàn)，測定結(jié)果令人滿意。鄭妍鵬等27用非水毛細(xì)管電泳采用甲醇為分離介質(zhì)，三(羥甲基)氨基甲烷-硼酸為支持電解質(zhì)，采用負(fù)高壓，使用電導(dǎo)檢測對虎杖中白藜蘆醇進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該方法分離度和靈敏度高。2.4  化學(xué)發(fā)光法化學(xué)發(fā)光分析法具有儀器設(shè)備簡單，測定快速，靈敏度高

13、，線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。姚型軍等28基于在堿性介質(zhì)中，白藜蘆醇對I-增強(qiáng)N-氯代丁二酰亞胺-魯米諾化學(xué)發(fā)光體系的阻抑作用，建立了測定白藜蘆醇的流動注射化學(xué)發(fā)光分析新方法。優(yōu)化了流動注射化學(xué)發(fā)光的分析條件和探討了反應(yīng)的可能機(jī)理。測定白藜蘆醇的線性響應(yīng)質(zhì)量濃度范圍為2.5×10-98.0×10-8g·ml-1，檢出限為6.3×10-10g·ml-1，用5.0×10-8g·ml-1的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行11次測定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.2%。應(yīng)用本法測定了虎杖、葡萄酒、葡萄皮樣品中的白藜蘆醇含量，結(jié)果滿意。姚型軍等29在選定的實(shí)

14、驗(yàn)條件下。即2.0×10-6 mol/L魯米諾1.0×10-3 mol/L NaOH。3.0×10-5mol/L N-溴代丁二酞亞胺，白藜蘆醇的濃度在6.0×10-71.0×10-5mg/ml范圍內(nèi)變化。其濃度與體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度I呈良好的線性關(guān)系，用濃度為5.0×10-6 mg/ml的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行11次測定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差( RSD)為0.35%。方法檢出限(3s/k)為8.15×10-8mg/ml。3  結(jié)語近年來，隨著對白藜蘆醇的研究不斷深入，對白藜蘆醇的提取和分析檢測的研究已取得了一定的進(jìn)展，一些新的

15、技術(shù)和手段不斷應(yīng)用于這一領(lǐng)域，并顯示出諸多優(yōu)勢和良好前景，但HPLC仍將發(fā)揮著主要作用。今后的研究主要方向：進(jìn)一步挖掘富含白藜蘆醇的植物品種，并且通過人工栽培和育種手段獲得高含量白藜蘆醇的品種；通過植物細(xì)胞培養(yǎng)法來生產(chǎn)白藜蘆醇和提高其含量，解決資源短缺的問題?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1Fi1ip V, Plockova MS midrkal J, et al. Resveratroland its antioxidant and antimicrobial effectivenessJ.Food Chem 2003,83 (4): 585.2Luzi G,Brisdelli f,Cinque

16、 B et al.Differential sensitivity to resveratrol-induced apoptosis of human chronic myeloid(k562)and acute lymphoblsstic(HSB-2) leukaemia cellsJ.Biochem Pharmacol ,2004,68(10):2019.3Mertens-Talcott S U,Percival S S,Ellagic acid and quercetin interact synergistically with resvertrol in the induction

17、of human leukemia cellaJ.Cancer Lett,2005,218(2):141.4張博.HPLC法測定紫金膠囊中白藜蘆醇的含量J.中草藥，2001,32(1):35.5蔣洪武.一種從中藥虎杖中提取白藜蘆醇的工藝P.中國專利CN1251361A,2000.6侯團(tuán)章,曾建國,梁 樺,等.一種從虎杖中制備白藜蘆醇的方法P.中國專利CN1341587A，2002.7曹庸.虎杖提取高純白藜蘆醇工藝P.中國專利CN1513822A,2004.8鄒賢德,舒 鑫.提高中藥虎杖中白藜蘆醇含量的方法P.中國專利CN1385535A,2002.9向海艷,周春山,陳龍勝,等.酶法提取虎杖中白

18、藜蘆醇新工藝研究J.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2004,24 (4):77.10李核,李攻科,張展霞.影響微波輔助萃取虎杖中白藜蘆醇產(chǎn)率的一些重要操作參數(shù)J.分析化學(xué),2003,31(11):1341.11劉樹興,程麗英,陳志亮,等.白藜蘆醇提取工藝的研究J.食品與發(fā)酵工業(yè),2004(12):45.12劉樹興,程麗英,楊大慶.虎杖白藜蘆醇和大黃素的綜合提取J.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005,17(5):632.13曾里,連春霞,夏之寧.超聲波提取虎杖白藜蘆醇及其液質(zhì)聯(lián)用分析J.重慶大學(xué)學(xué)報，2002,25(7):53.14江曙,朱蓉蓉,張芳等.虎杖中白藜蘆醇提取方法及工藝的優(yōu)化J.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2006,22(3):197.15蘇文強(qiáng)，楊磊，李艷杰，等.堿提取法從虎杖中分離白藜蘆醇的研究J.林產(chǎn)化工通訊,2004，38(1):17.16周錦珂,李金華,葛發(fā)歡.超臨界CO2萃取虎杖中白藜蘆醇的工藝研究J.中藥材,2004，27(9):675.17曹庸,于華忠,杜亞填,等.虎杖白藜蘆醇超臨界CO2萃取研究J.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2003,29(4):353.18鄒節(jié)明,梁芳琳,吳廣雄,等.CO2超臨界流體技術(shù)應(yīng)用于中藥有效成分萃取的實(shí)驗(yàn)研究J.中國中藥雜志,2003,8(5):413.19周建軍,張宏杰,楊培君,等.漢中地區(qū)虎杖中白藜蘆醇苷