2022年動物細胞融合

1、19571957年，日本科學(xué)家崗田善雄在培養(yǎng)動物細胞年，日本科學(xué)家崗田善雄在培養(yǎng)動物細胞時加入失去活性的時加入失去活性的仙臺病毒仙臺病毒，發(fā)現(xiàn)了細胞融，發(fā)現(xiàn)了細胞融合合(rngh)(rngh)、產(chǎn)生具有兩個核的細胞。、產(chǎn)生具有兩個核的細胞。 后來人后來人們用此方法又成功地誘導(dǎo)了不同種動物的們用此方法又成功地誘導(dǎo)了不同種動物的體細胞融合體細胞融合(rngh)(rngh)，并且能將雜種細胞培養(yǎng)，并且能將雜種細胞培養(yǎng)成活，動物細胞融合成活，動物細胞融合(rngh)(rngh)技術(shù)隨之誕生。技術(shù)隨之誕生?，F(xiàn)在這項技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細胞學(xué)、遺現(xiàn)在這項技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、病毒學(xué)等多種

2、學(xué)科的研究傳學(xué)、免疫學(xué)、病毒學(xué)等多種學(xué)科的研究工作中。工作中。第一頁，共三十七頁。細胞細胞(xbo)A細胞細胞(xbo)B雜種雜種(zzhng)細胞細胞滅活的病毒滅活的病毒物理法物理法化學(xué)法化學(xué)法仙臺病毒仙臺病毒皰疹病毒皰疹病毒新城雞瘟病毒新城雞瘟病毒 概念：概念：通過誘導(dǎo)兩個或多個細胞合并成一個雙核或多核通過誘導(dǎo)兩個或多個細胞合并成一個雙核或多核細胞的過程稱為細胞融合（細胞的過程稱為細胞融合（cell fusion）。如果）。如果2個不同的細個不同的細胞進行融合，則稱為細胞雜交（胞進行融合，則稱為細胞雜交（cell hybridization）第二頁，共三十七頁。融合融合(rngh)細胞的類

3、型：細胞的類型：同核體（同核體（homokaryon）：由同一生物個體的：由同一生物個體的細胞（基因型相同）所融合形成的融合細胞。細胞（基因型相同）所融合形成的融合細胞。異核體（異核體（heterokaryon）：）：來自不同基因型來自不同基因型的細胞所融合形成的雜交細胞。的細胞所融合形成的雜交細胞。第三頁，共三十七頁。1.生物方法（病毒生物方法（病毒(bngd)） 病毒是最早采用的融合劑。某些病毒被膜中有融病毒是最早采用的融合劑。某些病毒被膜中有融合蛋白合蛋白（fusion protein），），可介導(dǎo)病毒同宿主細胞可介導(dǎo)病毒同宿主細胞融合，也可介導(dǎo)細胞與細胞的融合。融合，也可介導(dǎo)細胞與細胞

4、的融合。 常用于誘導(dǎo)動物細胞融合的病毒有仙臺病毒、新城常用于誘導(dǎo)動物細胞融合的病毒有仙臺病毒、新城雞瘟病毒、皰疹病毒等。用作融合劑的病毒必須事先雞瘟病毒、皰疹病毒等。用作融合劑的病毒必須事先滅活滅活（紫外線或（紫外線或-丙內(nèi)酯），使病毒的感染活性喪失丙內(nèi)酯），使病毒的感染活性喪失而保留病毒的融合活性。而保留病毒的融合活性。 第二節(jié)第二節(jié) 誘導(dǎo)誘導(dǎo)(yudo)細胞融合的方細胞融合的方法法第四頁，共三十七頁。用滅活的病毒誘導(dǎo)用滅活的病毒誘導(dǎo)(yudo)的動物細胞融合過程示意圖的動物細胞融合過程示意圖 第五頁，共三十七頁。 仙臺病毒是最常用的病毒誘導(dǎo)融合劑。仙臺病毒是最常用的病毒誘導(dǎo)融合劑。優(yōu)點：優(yōu)

5、點：融合率較高、應(yīng)用廣（對各種動物融合率較高、應(yīng)用廣（對各種動物細胞都適宜）、容易培養(yǎng)（可在雞胚中大細胞都適宜）、容易培養(yǎng)（可在雞胚中大量繁殖）。量繁殖）。病毒介導(dǎo)融合的缺點：病毒介導(dǎo)融合的缺點： 不穩(wěn)定，在保存不穩(wěn)定，在保存(bocn)過程中融合活性會過程中融合活性會降低；制備過程比較煩瑣。此外，病毒引降低；制備過程比較煩瑣。此外，病毒引進細胞后，可能會對細胞的生命活動產(chǎn)生進細胞后，可能會對細胞的生命活動產(chǎn)生干擾。干擾。第六頁，共三十七頁。2. 2. 化學(xué)誘導(dǎo)融合化學(xué)誘導(dǎo)融合 化學(xué)融合劑主要有高級脂肪酸衍生物、脂質(zhì)化學(xué)融合劑主要有高級脂肪酸衍生物、脂質(zhì)體、鈣離子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋

6、體、鈣離子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白質(zhì)和多肽，白質(zhì)和多肽，其中最常用的是聚乙二醇（其中最常用的是聚乙二醇（PEGPEG）。）。 PEGPEG可以促使細胞可以促使細胞(xbo)(xbo)凝結(jié)、破壞互相接觸處凝結(jié)、破壞互相接觸處的細胞的細胞(xbo)(xbo)膜的磷脂雙分子層，從而使相互接觸膜的磷脂雙分子層，從而使相互接觸的細胞的細胞(xbo)(xbo)膜之間發(fā)生融合，進而細胞膜之間發(fā)生融合，進而細胞(xbo)(xbo)質(zhì)溝質(zhì)溝通，形成一個大的雙核或多核融合細胞通，形成一個大的雙核或多核融合細胞(xbo)(xbo)。 第七頁，共三十七頁。影響影響PEGPEG誘導(dǎo)融合效果的因素：誘導(dǎo)融合效果的

7、因素：分子量與濃度：分子大、濃度高的分子量與濃度：分子大、濃度高的PEG，有利，有利于融合，但毒性于融合，但毒性(d xn)也隨之增大。一般用分子也隨之增大。一般用分子量量PEG 1000-4000 ，40%-60%誘導(dǎo)時間：長，效率高，但毒性增大、容易誘導(dǎo)時間：長，效率高，但毒性增大、容易形成多核細胞形成多核細胞1. 溫度：溫度：38-40度度第八頁，共三十七頁。 3. 3.物理方法物理方法( (離心，震動，電融合離心，震動，電融合) ) 最常用的是電融合法最常用的是電融合法 細胞在電場中排列成串、聚集成串珠狀，然細胞在電場中排列成串、聚集成串珠狀，然后施加后施加(shji)(shji)高壓

8、電脈沖，促使細胞在相互接觸的高壓電脈沖，促使細胞在相互接觸的細胞膜處產(chǎn)生穿孔，導(dǎo)致細胞之間的細胞質(zhì)連通，細胞膜處產(chǎn)生穿孔，導(dǎo)致細胞之間的細胞質(zhì)連通，進而發(fā)生細胞融合。進而發(fā)生細胞融合。 細胞電融合技術(shù)有許多優(yōu)點，如細胞電融合技術(shù)有許多優(yōu)點，如誘導(dǎo)細胞融合誘導(dǎo)細胞融合的頻率高，對細胞無毒害作用，操作簡便，可重復(fù)的頻率高，對細胞無毒害作用，操作簡便，可重復(fù)性好。性好。 第九頁，共三十七頁。 兩種親本細胞融合的混合物中可能有多種類兩種親本細胞融合的混合物中可能有多種類型細胞，如：型細胞，如： 1) 1) 親本細胞親本細胞 2) 2) 同核體：同源細胞的融合體同核體：同源細胞的融合體 3) 3) 異核

9、體：非同源的細胞的融合體異核體：非同源的細胞的融合體 4) 4) 多核體：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合多核體：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體體 篩選的目的是為了篩選的目的是為了(wi le)(wi le)獲得優(yōu)良的雜種細胞獲得優(yōu)良的雜種細胞第三節(jié)第三節(jié) 雜種細胞雜種細胞(xbo)的篩選的篩選第十頁，共三十七頁。融合融合(rngh)細胞的篩選方法細胞的篩選方法1. 1. 利用細胞形態(tài)、大小、顏色利用細胞形態(tài)、大小、顏色(yns)(yns)差異篩選差異篩選2. 2. 利用抗藥性篩選利用抗藥性篩選 親本親本A A：對氨芐青霉素敏感，對卡那霉素不敏對氨芐青霉素敏感，對卡那霉素不敏感感 親本親本B B：

10、對卡那霉素敏感，對氨芐青霉素不敏感對卡那霉素敏感，對氨芐青霉素不敏感 雜種細胞可以在含有兩種抗生素的培養(yǎng)基上生雜種細胞可以在含有兩種抗生素的培養(yǎng)基上生長長 第十一頁，共三十七頁。3. 3. 利用營養(yǎng)互補篩選：利用營養(yǎng)互補篩選：細胞在缺乏一種或幾細胞在缺乏一種或幾種營養(yǎng)成分時，不能生長繁殖，即營養(yǎng)缺陷種營養(yǎng)成分時，不能生長繁殖，即營養(yǎng)缺陷型細胞。利用兩種親本細胞營養(yǎng)互補作用原型細胞。利用兩種親本細胞營養(yǎng)互補作用原理理(yunl)(yunl)可以篩選雜種細胞?？梢院Y選雜種細胞。 親本親本A A：色氨酸缺陷型色氨酸缺陷型 親本親本B B：蘇氨酸缺陷型蘇氨酸缺陷型 雜種細胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培

11、雜種細胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而親本細胞均會死亡。養(yǎng)基上培養(yǎng)，而親本細胞均會死亡。第十二頁，共三十七頁。4. 利用基因缺陷互補篩選利用基因缺陷互補篩選 最常用的是在親本細胞的嘧啶和嘌呤代謝途徑最常用的是在親本細胞的嘧啶和嘌呤代謝途徑中引入中引入缺陷突變?nèi)毕萃蛔儊砗Y選雜交來篩選雜交(zjio)細胞，即細胞，即HAT篩選系篩選系統(tǒng)。統(tǒng)。 細胞合成核苷酸有細胞合成核苷酸有2條途徑：從頭合成途徑和補救途條途徑：從頭合成途徑和補救途徑。徑。 阻斷從頭合成核苷酸阻斷從頭合成核苷酸途徑的物質(zhì)途徑的物質(zhì)(wzh)：次黃嘌呤次黃嘌呤(hypoxantin，H)、氨基蝶呤、氨基蝶呤(aminop

12、terin，A)和胸腺嘧和胸腺嘧啶脫氧核苷啶脫氧核苷(thymidin，T)。HAT培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：含有含有H、A、T的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基第十三頁，共三十七頁。 在在HATHAT培養(yǎng)基上，細胞從頭合成培養(yǎng)基上，細胞從頭合成核苷酸核苷酸途徑被阻途徑被阻斷斷(z dun)(z dun)，只能利用補救合成途徑。，只能利用補救合成途徑。 在補救途徑中，次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶在補救途徑中，次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（簡稱簡稱HGPRTHGPRT）和胸苷酸激酶）和胸苷酸激酶（TKTK）起重要作用。起重要作用。 HGPRTHGPRT- -和和TKTK- -的細胞不能增殖，的細胞不能增殖，但但HGPRTH

13、GPRT- -TK-TK+ +與與HGPRTHGPRT+ +-TK-TK- -融合細胞融合細胞則可以增殖。則可以增殖。第十四頁，共三十七頁。鼠人XTK-HGPRT+TK+HGPRT-鼠人鼠人鼠 人TK+和HGPRT+HATHATHAT不分裂(fnli)不分裂(fnli)分裂(fnli)HAT篩選示意圖第十五頁，共三十七頁。第四節(jié)第四節(jié) 融合細胞的克隆融合細胞的克隆(k ln)化培化培養(yǎng)養(yǎng) 篩選出來的融合細胞仍屬于異質(zhì)性的細胞篩選出來的融合細胞仍屬于異質(zhì)性的細胞群，不完全是純系，需要進一步純化、獲得群，不完全是純系，需要進一步純化、獲得同質(zhì)性的細胞群。常用方法是克隆化培養(yǎng)。同質(zhì)性的細胞群。常用方

14、法是克隆化培養(yǎng)?？寺』囵B(yǎng)：克隆化培養(yǎng)：培養(yǎng)單個雜交細胞、以得到遺傳培養(yǎng)單個雜交細胞、以得到遺傳(ychun)(ychun)特征相同而穩(wěn)定的雜種細胞系。特征相同而穩(wěn)定的雜種細胞系。 第十六頁，共三十七頁。 半固體培養(yǎng)法半固體培養(yǎng)法= =平板培養(yǎng)平板培養(yǎng) 單細胞在軟瓊脂（或者瓊脂糖）培養(yǎng)單細胞在軟瓊脂（或者瓊脂糖）培養(yǎng)基上增殖后不能移動，形成集落。待細胞基上增殖后不能移動，形成集落。待細胞集落長到肉眼可見后，用吸管從瓊脂上挑集落長到肉眼可見后，用吸管從瓊脂上挑出來出來( (一般一般8-108-10天后天后(tin hu)(tin hu) )，再移到液體，再移到液體培養(yǎng)基中，進行繁殖。培養(yǎng)基中，進

15、行繁殖。第十七頁，共三十七頁。2. 2. 有限稀釋法有限稀釋法 將細胞稀釋到將細胞稀釋到100100個個/ml/ml，理論上每，理論上每0.01ml(100.01ml(10l) )含有含有(hn yu)(hn yu)1 1個細胞。取個細胞。取0.01ml0.01ml細胞液在培養(yǎng)板細胞液在培養(yǎng)板( (如如9696孔板孔板) )的小孔中培養(yǎng)，則可獲得單個細胞形成的集落。的小孔中培養(yǎng)，則可獲得單個細胞形成的集落。1) 1) 取取1.0 ml 51.0 ml 510104 4/ml/ml細胞細胞+4ml+4ml培養(yǎng)基稀釋，得培養(yǎng)基稀釋，得 1 110104 4/ml./ml.2) 2) 取取0.5ml

16、 10.5ml 110104 4/ml/ml細胞液細胞液+4.5ml+4.5ml培養(yǎng)基稀釋，培養(yǎng)基稀釋， 得得1 110103 3/ml./ml.3) 3) 取取0.5ml10.5ml110103 3/ml/ml細胞液細胞液+4.5ml+4.5ml培養(yǎng)基稀釋，得培養(yǎng)基稀釋，得100 100 cells/ml.cells/ml.4) 4) 取取0.01ml0.01ml的的 100 cells/ml100 cells/ml細胞液于培養(yǎng)板小孔，細胞液于培養(yǎng)板小孔，加加0.1 ml0.1 ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)后得雜種細胞系。培養(yǎng)基，培養(yǎng)后得雜種細胞系。第十八頁，共三十七頁。3. 3. 顯微鏡操作法顯微鏡操

17、作法 通過顯微操作分離雜交單細胞、分別單獨培養(yǎng)。通過顯微操作分離雜交單細胞、分別單獨培養(yǎng)。4. 4. 蓋片分離法蓋片分離法1) 1) 用釘錘用釘錘(dngchu)(dngchu)于潔凈的橡膠上砸干凈蓋玻片；于潔凈的橡膠上砸干凈蓋玻片；2) 2) 選擇碎塊、大小形態(tài)適用碎片；選擇碎塊、大小形態(tài)適用碎片；3) 3) 加培養(yǎng)液、進行細胞培養(yǎng)；加培養(yǎng)液、進行細胞培養(yǎng)；4) 4) 倒置鏡下選細胞，挑出單細胞玻片；倒置鏡下選細胞，挑出單細胞玻片；5) 5) 進行單個細胞培養(yǎng)。進行單個細胞培養(yǎng)。第十九頁，共三十七頁。5. 5. 熒光激活分離法熒光激活分離法 用一種熒光激活細胞分類器（用一種熒光激活細胞分類器

18、（Fluorescence Activated Cell Sorter，F(xiàn)ACS）分離雜交細胞。）分離雜交細胞。 原理：將細胞經(jīng)熒光抗體染色后，經(jīng)噴嘴形成單個細胞的線原理：將細胞經(jīng)熒光抗體染色后，經(jīng)噴嘴形成單個細胞的線形液滴，在激發(fā)形液滴，在激發(fā)(jf)光的激發(fā)光的激發(fā)(jf)下，熒光素發(fā)射熒光，此信號下，熒光素發(fā)射熒光，此信號由光電倍增管接收，再結(jié)合細胞形態(tài)大小產(chǎn)生光散射信號，經(jīng)由光電倍增管接收，再結(jié)合細胞形態(tài)大小產(chǎn)生光散射信號，經(jīng)電腦處理，產(chǎn)生信號并與預(yù)定的信號對比，根據(jù)細胞熒光強度電腦處理，產(chǎn)生信號并與預(yù)定的信號對比，根據(jù)細胞熒光強度及細胞大小不同，將細胞分成不同級別，在電場中發(fā)生偏離，

19、及細胞大小不同，將細胞分成不同級別，在電場中發(fā)生偏離，而分別收集于不同容器中。而分別收集于不同容器中。第二十頁，共三十七頁。第五節(jié)第五節(jié) 細胞融合技術(shù)細胞融合技術(shù)(jsh)的應(yīng)用的應(yīng)用 動物體受抗原刺激后可產(chǎn)生動物體受抗原刺激后可產(chǎn)生抗體抗體，抑制抗原的作用；增，抑制抗原的作用；增加身體的加身體的抗體抗體就可以提高機體的抗病能力。就可以提高機體的抗病能力。 抗體具有特異性，其特異性取決于抗原分子的決定簇?？贵w具有特異性，其特異性取決于抗原分子的決定簇。 抗原決定簇：抗原決定簇：存在于抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)存在于抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)(huxu)基團，一般由基團，一般由5

20、8個氨基酸或單糖或核苷酸殘基組成。個氨基酸或單糖或核苷酸殘基組成。一、一、B B淋巴細胞雜交瘤生產(chǎn)淋巴細胞雜交瘤生產(chǎn)(shngchn)(shngchn)單克隆抗體單克隆抗體第二十一頁，共三十七頁。 各種抗原分子具有很多各種抗原分子具有很多抗原決定簇抗原決定簇，不同抗原的決定，不同抗原的決定簇數(shù)目不同，如白喉類毒素有簇數(shù)目不同，如白喉類毒素有8 8個，流感病毒有個，流感病毒有4040多個。多個?？乖瓫Q定簇大多存在于抗原的表面，但也有隱藏在抗抗原決定簇大多存在于抗原的表面，但也有隱藏在抗原內(nèi)部。原內(nèi)部。 抗體是由抗體是由B B淋巴細胞淋巴細胞分化形成的漿細胞合成分化形成的漿細胞合成(hchng)(

21、hchng)、分泌的。分泌的。每一個每一個B B淋巴細胞在成熟的過程中只產(chǎn)生一種抗淋巴細胞在成熟的過程中只產(chǎn)生一種抗體。動物體。動物脾臟脾臟有上百萬種不同的有上百萬種不同的B B淋巴細胞，因此，當(dāng)機淋巴細胞，因此，當(dāng)機體受體受抗原抗原刺激時，每種刺激時，每種B B淋巴細胞產(chǎn)生一種抗體（單一抗淋巴細胞產(chǎn)生一種抗體（單一抗體），整個動物可以產(chǎn)生眾多不同的抗體（多克隆抗體）。體），整個動物可以產(chǎn)生眾多不同的抗體（多克隆抗體）。用免疫動物生產(chǎn)、制備抗體效率低，且多克隆抗體應(yīng)用有用免疫動物生產(chǎn)、制備抗體效率低，且多克隆抗體應(yīng)用有很多缺陷，分離這些不同的抗體極為困難。很多缺陷，分離這些不同的抗體極為困難。

22、第二十二頁，共三十七頁。 選出一個合成一種專一選出一個合成一種專一(zhuny)(zhuny)抗體的細胞進行培養(yǎng)，就可得抗體的細胞進行培養(yǎng)，就可得到由單細胞經(jīng)增殖而形成的細胞群，即到由單細胞經(jīng)增殖而形成的細胞群，即單克隆細胞單克隆細胞。單克隆細。單克隆細胞合成針對一種抗原決定簇的抗體，稱為胞合成針對一種抗原決定簇的抗體，稱為單克隆抗體單克隆抗體。單克單克隆抗體具有理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結(jié)隆抗體具有理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結(jié)合特異性強、質(zhì)量可控等優(yōu)點合特異性強、質(zhì)量可控等優(yōu)點，用途：，用途：1 1醫(yī)學(xué)診斷試劑醫(yī)學(xué)診斷試劑 廣泛應(yīng)用于酶聯(lián)免疫、放射免疫分析、免疫組化和

23、流式廣泛應(yīng)用于酶聯(lián)免疫、放射免疫分析、免疫組化和流式細胞儀等技術(shù)。單克隆抗體促進了細胞儀等技術(shù)。單克隆抗體促進了商品化試劑盒商品化試劑盒的發(fā)展，試的發(fā)展，試劑盒靈敏度高、使用方便、快速，用于劑盒靈敏度高、使用方便、快速，用于病原微生物抗原、病原微生物抗原、腫瘤抗原、免疫細胞及其亞群的檢測，激素、細胞因子的腫瘤抗原、免疫細胞及其亞群的檢測，激素、細胞因子的測定。測定。第二十三頁，共三十七頁。2. 2. 食品安全的檢測食品安全的檢測 食品中的毒素（如黃曲霉毒素）、有機農(nóng)藥的檢測。食品中的毒素（如黃曲霉毒素）、有機農(nóng)藥的檢測。方便方便(fngbin)(fngbin)、靈敏、靈敏3蛋白質(zhì)的提純蛋白質(zhì)的

24、提純單克隆抗體是親和層析中重要的配體。將單克隆抗體單克隆抗體是親和層析中重要的配體。將單克隆抗體吸附在一個惰性的固相基質(zhì)（如吸附在一個惰性的固相基質(zhì)（如Speharose 2B、4B、6B等）等）上，并制備成層析柱。當(dāng)樣品流經(jīng)層析柱時，待分離的抗上，并制備成層析柱。當(dāng)樣品流經(jīng)層析柱時，待分離的抗原可與固相的單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，其余成分不能原可與固相的單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，其余成分不能與之結(jié)合。將層析柱充分洗脫后，改變洗脫液的離子強度與之結(jié)合。將層析柱充分洗脫后，改變洗脫液的離子強度或或pH，欲分離的抗原與抗體解離，收集洗脫液便可得到，欲分離的抗原與抗體解離，收集洗脫液便可得到(d d

25、o)欲純化的抗原。欲純化的抗原。第二十四頁，共三十七頁。4 4 腫瘤的導(dǎo)向治療（腫瘤的導(dǎo)向治療（生物導(dǎo)彈生物導(dǎo)彈） 化療、放療：無選擇性，副作用大化療、放療：無選擇性，副作用大 把腫瘤單克隆抗體與把腫瘤單克隆抗體與抗癌抗癌藥物結(jié)合起來，就成藥物結(jié)合起來，就成為為 “ “生物導(dǎo)彈生物導(dǎo)彈”。把這種抗體。把這種抗體“導(dǎo)彈導(dǎo)彈”注射到注射到癌癥患者的血液中，它就會在患者體內(nèi)追蹤癌癥患者的血液中，它就會在患者體內(nèi)追蹤(zhuzng)(zhuzng)并并附著于癌細胞附著于癌細胞上，然后與抗體結(jié)合的抗癌藥物殺上，然后與抗體結(jié)合的抗癌藥物殺傷和破壞癌細胞，而且很少損傷正常組織細胞。傷和破壞癌細胞，而且很少損

26、傷正常組織細胞。這種抗體這種抗體“導(dǎo)彈導(dǎo)彈”具有高度選擇性，對癌細胞具有高度選擇性，對癌細胞命中率高、殺傷力強大、副作用小等優(yōu)點。命中率高、殺傷力強大、副作用小等優(yōu)點。第二十五頁，共三十七頁。 動物細胞融合技術(shù)為單克隆抗體的制備提供了個全新、動物細胞融合技術(shù)為單克隆抗體的制備提供了個全新、高效的方法。高效的方法。 1975年，年，G. Kohler（德國（德國）和和C. Milstein（阿根廷阿根廷、英、英國雙國籍國雙國籍）把產(chǎn)生抗體的淋巴細胞與骨髓瘤細胞進行融把產(chǎn)生抗體的淋巴細胞與骨髓瘤細胞進行融合，形成合，形成(xngchng)雜交瘤細胞雜交瘤細胞，證明了這種細胞既有，證明了這種細胞既有

27、骨髓瘤骨髓瘤細胞無限增殖細胞無限增殖的能力，又有的能力，又有淋巴細胞產(chǎn)生抗體淋巴細胞產(chǎn)生抗體的功能。的功能。因此，這種雜交瘤細胞就能產(chǎn)生大量單一類型的高純度因此，這種雜交瘤細胞就能產(chǎn)生大量單一類型的高純度抗體，抗體，單克隆抗體單克隆抗體。第二十六頁，共三十七頁。Georges J.F. KhlerCsar MilsteinNiels K. Jerne 1984年，年， G. Kohler、C. Milstein和和Niels K. Jerne獲得獲得Nobel獎，表彰獎，表彰(biozhng)他們關(guān)于免疫控制機制理論的研究以及他們關(guān)于免疫控制機制理論的研究以及開發(fā)制備單克隆抗體技術(shù)。開發(fā)制備單

28、克隆抗體技術(shù)。第二十七頁，共三十七頁。 單克隆抗體技術(shù)的核心單克隆抗體技術(shù)的核心(hxn)是用是用骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞(myeloma cell)與經(jīng)特定抗原免疫刺激的與經(jīng)特定抗原免疫刺激的B淋巴細胞淋巴細胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到融合得到雜交瘤雜交瘤細胞細胞(hybridoma cell)，雜交瘤細胞既能象骨髓瘤細，雜交瘤細胞既能象骨髓瘤細胞那樣在體外無限增殖，又具有胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細胞產(chǎn)生特淋巴細胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術(shù)又稱為雜單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)交瘤技術(shù)(hybrid

29、oma technology）。）。第二十八頁，共三十七頁。動物細胞融合技術(shù)動物細胞融合技術(shù)(jsh)為生產(chǎn)單克隆抗體過程為生產(chǎn)單克隆抗體過程第二十九頁，共三十七頁。（1）免疫免疫(miny)小鼠、制備小鼠、制備B淋巴細胞淋巴細胞 取取6-8周齡周齡Balb/C雌鼠，基礎(chǔ)免疫雌鼠，基礎(chǔ)免疫2周后，再靜脈加強免疫周后，再靜脈加強免疫一次，一次，3-5天后分離、制備天后分離、制備(zhbi)B淋巴細胞，用無血清培養(yǎng)液淋巴細胞，用無血清培養(yǎng)液洗洗3次次(37)，并計細胞數(shù)和測定活力細胞。，并計細胞數(shù)和測定活力細胞。（2）制備制備(zhbi)骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞 收集骨髓瘤細胞，用無血清培養(yǎng)液洗收集骨

30、髓瘤細胞，用無血清培養(yǎng)液洗3次次(37)，計數(shù)，計數(shù)活力細胞活力細胞(不少于不少于90)。第三十頁，共三十七頁。（3）細胞融合細胞融合(1) 按1：5-10混合B淋巴細胞和骨髓瘤細胞后，離心棄去上清，并以消毒濾紙吸凈多余上清。(2) 將1ml 40的PEG液一滴滴加入細胞混合物中，在60秒內(nèi)加完，同時并不斷輕微轉(zhuǎn)動離心管或用手指輕彈離心管；(3)在不斷轉(zhuǎn)動離心管中加1ml無血清培養(yǎng)液，60秒鐘內(nèi)加完；(4)于5分鐘內(nèi)慢慢加入20ml無血清培養(yǎng)液；此時(c sh)細胞對機械損傷非常敏感，第三十一頁，共三十七頁。HATHAT選擇：選擇：淋巴細胞及其融合細胞：淋巴細胞及其融合細胞：不能生長不能生長(

31、shngzhng)(shngzhng)，5 57 7天死亡；天死亡；骨髓瘤細胞及其融合細胞：骨髓瘤細胞及其融合細胞：DNADNA從頭合成途徑被阻斷；從頭合成途徑被阻斷；HGPRTHGPRT缺乏，缺乏，DNADNA合成的補救途徑受阻，不能生長，合成的補救途徑受阻，不能生長，5 57 7天死亡；天死亡；淋巴細胞和骨髓瘤融合細胞：淋巴細胞和骨髓瘤融合細胞：能生長能生長(5)離心(800轉(zhuǎn)/分，8分鐘)，去上清，用完全(wnqun)培養(yǎng)液10ml懸浮，輕輕混勻；(6)取96孔板，每孔加50l，再加取等體積細胞懸液。(7)在CO2培養(yǎng)箱中37培養(yǎng)； 24h后更換成HAT選擇性培養(yǎng)液第三十二頁，共三十七頁。（4） 雜交瘤細胞雜交瘤細胞(xbo)的選擇和克隆化培的選擇和克隆化培養(yǎng)養(yǎng)第一次抗體篩選：第一次抗體篩選：融合培養(yǎng)融合培養(yǎng)(piyng)(piyng)24h24h后更換成后更換成HATHAT選擇性培養(yǎng)選擇性培養(yǎng)(piyng)(piyng)液，雜交瘤細胞生長增殖、液，雜交瘤細胞生長增殖、形成細胞群，再利用免疫學(xué)方法檢測其抗體合形成細