中藥中黃曲霉毒素的檢測(cè)

1、中藥中黃曲霉毒素的測(cè)定中藥中黃曲霉毒素的測(cè)定目錄目錄真菌毒素簡(jiǎn)介真菌毒素簡(jiǎn)介黃曲霉毒素概述黃曲霉毒素概述黃曲霉毒素現(xiàn)有檢測(cè)方法介紹黃曲霉毒素現(xiàn)有檢測(cè)方法介紹黃曲霉毒素檢測(cè)藥典收載情況黃曲霉毒素檢測(cè)藥典收載情況藥典檢測(cè)方法詳解藥典檢測(cè)方法詳解注意事項(xiàng)及實(shí)驗(yàn)室建議注意事項(xiàng)及實(shí)驗(yàn)室建議真菌毒素簡(jiǎn)介真菌毒素簡(jiǎn)介真菌毒素真菌毒素：由產(chǎn)毒真菌在適宜的環(huán)境條件下產(chǎn)：由產(chǎn)毒真菌在適宜的環(huán)境條件下產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，由真菌菌核產(chǎn)生。生的有毒代謝產(chǎn)物，由真菌菌核產(chǎn)生。Mycotoxin：源于希臘語(yǔ)（：源于希臘語(yǔ)（Mykes）和拉丁語(yǔ)）和拉丁語(yǔ)（Toxicum）常見(jiàn)真菌毒素分類常見(jiàn)真菌毒素分類真菌種類真菌種類所產(chǎn)毒

2、素所產(chǎn)毒素曲霉屬曲霉屬黃曲霉毒素、赭曲霉毒素黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A A鐮刀菌屬鐮刀菌屬玉米赤霉烯酮、玉米赤霉烯酮、T-2T-2毒素、嘔毒素、嘔吐毒素、伏馬毒素吐毒素、伏馬毒素青霉屬青霉屬展青霉素、桔青霉素展青霉素、桔青霉素真菌毒素監(jiān)控意義真菌毒素監(jiān)控意義真菌毒素對(duì)食品安全的危害真菌毒素對(duì)食品安全的危害真菌毒素對(duì)種、養(yǎng)殖業(yè)的危害真菌毒素對(duì)種、養(yǎng)殖業(yè)的危害真菌毒素對(duì)制藥行業(yè)的危害（中藥）真菌毒素對(duì)制藥行業(yè)的危害（中藥）國(guó)際貿(mào)易中作為技術(shù)壁壘國(guó)際貿(mào)易中作為技術(shù)壁壘在國(guó)際反恐和戰(zhàn)爭(zhēng)中，真菌毒素可作為大規(guī)模在國(guó)際反恐和戰(zhàn)爭(zhēng)中，真菌毒素可作為大規(guī)模殺傷性生化武器殺傷性生化武器黃曲霉毒素概述黃曲霉毒素概述

3、黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉等菌種產(chǎn)生的黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉等菌種產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物次生代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素的發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素的發(fā)現(xiàn)1960年，在英國(guó)東南部一些農(nóng)場(chǎng)中，有大約年，在英國(guó)東南部一些農(nóng)場(chǎng)中，有大約10萬(wàn)只火雞不明原由地突然死亡。萬(wàn)只火雞不明原由地突然死亡。1961年發(fā)現(xiàn)火雞飼料中混有的花生粉能夠使大年發(fā)現(xiàn)火雞飼料中混有的花生粉能夠使大鼠誘發(fā)肝癌。鼠誘發(fā)肝癌。1962年，研究發(fā)現(xiàn)花生粉中含有一種熒光物質(zhì)年，研究發(fā)現(xiàn)花生粉中含有一種熒光物質(zhì)是導(dǎo)致?；痣u死亡的病因，這種熒光物質(zhì)被證是導(dǎo)致?；痣u死亡的病因，這種熒光物質(zhì)被證實(shí)為黃曲霉的代謝產(chǎn)物，故命名為實(shí)為黃曲霉的代謝產(chǎn)物，故命名為“黃

4、曲霉毒黃曲霉毒素素(Aflatoxins)”。存在極其廣泛存在極其廣泛主要存在于土壤，動(dòng)植物及各種堅(jiān)果中。家庭主要存在于土壤，動(dòng)植物及各種堅(jiān)果中。家庭自制發(fā)酵食品等也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素。自制發(fā)酵食品等也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素。一般在熱帶和亞熱帶地區(qū)，食品中黃曲霉毒素一般在熱帶和亞熱帶地區(qū)，食品中黃曲霉毒素的檢出率比較高。的檢出率比較高。未能及時(shí)曬干或儲(chǔ)藏不當(dāng)?shù)募Z食容易產(chǎn)生，在未能及時(shí)曬干或儲(chǔ)藏不當(dāng)?shù)募Z食容易產(chǎn)生，在農(nóng)作物正常的生長(zhǎng)期中也可以形成。農(nóng)作物正常的生長(zhǎng)期中也可以形成。毒性極強(qiáng)毒性極強(qiáng)1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)（的癌癥研究機(jī)構(gòu)（I

5、ARC）劃定為）劃定為類致癌物，類致癌物，是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)，僅次肉毒毒素，是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)，僅次肉毒毒素，是目前已知霉菌中毒性最強(qiáng)的。是目前已知霉菌中毒性最強(qiáng)的。急性毒性：比氰化鉀大急性毒性：比氰化鉀大10倍，比砒霜大倍，比砒霜大68倍倍慢性毒性：肝臟損害，呈急性肝炎、出血性壞慢性毒性：肝臟損害，呈急性肝炎、出血性壞死、肝細(xì)胞脂肪變性和膽管增生。脾臟和胰臟死、肝細(xì)胞脂肪變性和膽管增生。脾臟和胰臟也有輕度的病變。也有輕度的病變。中藥中容易產(chǎn)生黃曲霉毒素的品中藥中容易產(chǎn)生黃曲霉毒素的品種種種子、果實(shí)、糧谷類中藥材種子、果實(shí)、糧谷類中藥材發(fā)酵類中藥材發(fā)酵類中藥材動(dòng)物類中藥材動(dòng)物類中藥

6、材油性成分多的中藥材油性成分多的中藥材含上述種類藥材的中成藥含上述種類藥材的中成藥黃曲霉毒素的種類及性質(zhì)黃曲霉毒素的種類及性質(zhì)根據(jù)在紫外線照射下產(chǎn)生熒光顏色的不同，根據(jù)在紫外線照射下產(chǎn)生熒光顏色的不同，分為分為B B族族和和G G族族兩大類及其衍生物兩大類及其衍生物藍(lán)色熒光藍(lán)色熒光黃綠色熒光黃綠色熒光化學(xué)結(jié)構(gòu)化學(xué)結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu)：是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的基本結(jié)構(gòu)：是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的二呋二呋喃香豆素喃香豆素的衍生化合物的衍生化合物目前發(fā)現(xiàn)約目前發(fā)現(xiàn)約20余種余種，已分離鑒定出，已分離鑒定出12種：種：B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇。和毒醇。B1：最常見(jiàn)、毒性及致

7、癌性最強(qiáng)：最常見(jiàn)、毒性及致癌性最強(qiáng)化學(xué)結(jié)構(gòu)式化學(xué)結(jié)構(gòu)式理化性質(zhì)理化性質(zhì)黃曲霉毒素相對(duì)分子量黃曲霉毒素相對(duì)分子量312346難溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有機(jī)難溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有機(jī)溶劑，但不溶于石油醚、己烷和乙醚溶劑，但不溶于石油醚、己烷和乙醚在中性及酸性溶液中較穩(wěn)定，但在在中性及酸性溶液中較穩(wěn)定，但在pH為為13的強(qiáng)的強(qiáng)酸性溶液中稍有分解，在酸性溶液中稍有分解，在pH為為910的的堿性溶液堿性溶液中分解迅速中分解迅速純品為無(wú)色結(jié)晶純品為無(wú)色結(jié)晶耐高溫，黃曲霉毒素耐高溫，黃曲霉毒素B1的分解溫度為的分解溫度為268紫外線對(duì)低濃度黃曲霉毒素有一定的破壞性紫外線對(duì)低濃度黃

8、曲霉毒素有一定的破壞性黃曲霉毒素現(xiàn)有檢測(cè)方法介紹黃曲霉毒素現(xiàn)有檢測(cè)方法介紹薄層層析法：靈敏度低，定量困難薄層層析法：靈敏度低，定量困難HPLC-紫外檢測(cè)法：不衍生，靈敏度低，采用紫外檢測(cè)法：不衍生，靈敏度低，采用UPLC可以增強(qiáng)靈敏度可以增強(qiáng)靈敏度HPLC-熒光檢測(cè)法：需衍生，靈敏度高熒光檢測(cè)法：需衍生，靈敏度高高效液相色譜高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法：不需衍生，靈敏度串聯(lián)質(zhì)譜法：不需衍生，靈敏度高，假陽(yáng)性少，成本高高，假陽(yáng)性少，成本高免疫化學(xué)分析方法免疫化學(xué)分析方法 酶聯(lián)免疫吸附法：酶聯(lián)免疫吸附法：快速、簡(jiǎn)便、單一毒素、快速、簡(jiǎn)便、單一毒素、假陽(yáng)多假陽(yáng)多 免疫親和柱免疫親和柱- -熒光分光光度法

9、熒光分光光度法：高效、無(wú)毒、：高效、無(wú)毒、假陽(yáng)多假陽(yáng)多 微柱篩選法微柱篩選法：半定量，測(cè)總量：半定量，測(cè)總量 一步式黃曲霉毒素檢測(cè)金標(biāo)試紙法一步式黃曲霉毒素檢測(cè)金標(biāo)試紙法：快速、：快速、現(xiàn)場(chǎng)大批量初篩現(xiàn)場(chǎng)大批量初篩黃曲霉毒素檢測(cè)藥典收載情況黃曲霉毒素檢測(cè)藥典收載情況2005年增補(bǔ)本附錄年增補(bǔ)本附錄 第一次增加了黃曲霉毒素測(cè)定法第一次增加了黃曲霉毒素測(cè)定法2010年版一部年版一部 正文：僵蠶、陳皮、酸棗仁、桃仁、胖大海品正文：僵蠶、陳皮、酸棗仁、桃仁、胖大海品種項(xiàng)下增加了黃曲霉毒素殘留量檢查種項(xiàng)下增加了黃曲霉毒素殘留量檢查 附錄：繼續(xù)收載了黃曲霉毒素測(cè)定法附錄：繼續(xù)收載了黃曲霉毒素測(cè)定法2010

10、年版一部第二增補(bǔ)本年版一部第二增補(bǔ)本修訂了附錄方法修訂了附錄方法 刪除了流速規(guī)定刪除了流速規(guī)定增訂了另一種衍生方法：即光化學(xué)衍生法增訂了另一種衍生方法：即光化學(xué)衍生法 取消了免疫親和柱的品牌規(guī)定取消了免疫親和柱的品牌規(guī)定2015年版四部通則年版四部通則2351黃曲霉毒素測(cè)定法黃曲霉毒素測(cè)定法 增加了第二法：高效液相色譜增加了第二法：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法串聯(lián)質(zhì)譜法 增加附注：增加附注：“當(dāng)測(cè)定結(jié)果超出限度時(shí)，采用第二當(dāng)測(cè)定結(jié)果超出限度時(shí)，采用第二法進(jìn)行確認(rèn)法進(jìn)行確認(rèn)”2015年版四部通則增加年版四部通則增加中藥中真菌毒素測(cè)定指導(dǎo)中藥中真菌毒素測(cè)定指導(dǎo)原則原則 基本原則（中藥中真菌毒素的分類、

11、監(jiān)控品種、基本原則（中藥中真菌毒素的分類、監(jiān)控品種、測(cè)定方法、限值擬定）測(cè)定方法、限值擬定） 基本內(nèi)容（高效液相色譜法、高效液相色譜基本內(nèi)容（高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)質(zhì)譜聯(lián)用法）譜聯(lián)用法）2015年版四部通則年版四部通則9302 中藥有害殘留物限量制中藥有害殘留物限量制定指導(dǎo)原則定指導(dǎo)原則中關(guān)于黃曲霉毒素的規(guī)定中關(guān)于黃曲霉毒素的規(guī)定 “由于黃曲霉毒素毒性強(qiáng)，目前國(guó)際上由于黃曲霉毒素毒性強(qiáng)，目前國(guó)際上不建議不建議設(shè)定黃曲霉毒素的安全耐受量和無(wú)毒作用劑量設(shè)定黃曲霉毒素的安全耐受量和無(wú)毒作用劑量，也無(wú)最大限量理論值計(jì)算公式，限量越低越，也無(wú)最大限量理論值計(jì)算公式，限量越低越好好”。中國(guó)藥典中

12、國(guó)藥典20152015年版正文收載品種年版正文收載品種根及根莖類：遠(yuǎn)志根及根莖類：遠(yuǎn)志果實(shí)種子類：大棗、肉豆蔻、決明子、麥芽、陳果實(shí)種子類：大棗、肉豆蔻、決明子、麥芽、陳皮、使君子、柏子仁、胖大海、蓮子、桃仁、檳皮、使君子、柏子仁、胖大海、蓮子、桃仁、檳郎、酸棗仁、薏苡仁郎、酸棗仁、薏苡仁動(dòng)物類：僵蠶、水蛭、地龍、全蝎、蜈蚣動(dòng)物類：僵蠶、水蛭、地龍、全蝎、蜈蚣共共19種種，較，較2010年版藥典年版藥典增加增加14種種黃曲霉毒素藥典檢測(cè)方法詳解黃曲霉毒素藥典檢測(cè)方法詳解液相條件：液相條件：C18，甲醇，甲醇-乙腈乙腈-水（水（40:18:42）衍生方式：衍生方式：柱后碘衍生、柱后光化學(xué)衍生柱后

13、碘衍生、柱后光化學(xué)衍生混合對(duì)照品溶液的制備：混合對(duì)照品溶液的制備：液體標(biāo)液液體標(biāo)液（B1B2G1G2=10.310.3 ug/ml）梯度稀釋）梯度稀釋500倍倍供試品溶液的制備：供試品溶液的制備：15g粉末，粉末，3gNaCl，70%甲醇提取，免疫親和柱純化甲醇提取，免疫親和柱純化測(cè)定：測(cè)定： 吸取混合對(duì)照品溶液吸取混合對(duì)照品溶液5l、10l、15l、20l、25l，注入色譜儀，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。，注入色譜儀，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取供試品溶液吸取供試品溶液20-25l，測(cè)定，測(cè)定方法來(lái)源：方法來(lái)源：中國(guó)藥典中國(guó)藥典2015年版四部通則年版四部通則2351黃曲霉毒素測(cè)定法黃曲霉毒素測(cè)定法基本步驟基本步驟

14、 提取提取 凈化（活化、上樣、洗雜、洗脫）凈化（活化、上樣、洗雜、洗脫） 測(cè)定測(cè)定 隨行質(zhì)量控制（質(zhì)控樣、隨行加樣回收）隨行質(zhì)量控制（質(zhì)控樣、隨行加樣回收）泵流操作架泵流操作架免疫親和柱免疫親和柱HPLC-熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器光化學(xué)衍生器光化學(xué)衍生器自動(dòng)固相萃取儀自動(dòng)固相萃取儀凈化步驟凈化步驟取取15ml（離心后的提取液），加水至（離心后的提取液），加水至50ml濾過(guò)，取濾過(guò)，取20ml，通過(guò)免疫親和柱，通過(guò)免疫親和柱，流速流速3ml/min加水洗滌兩次，每次加水洗滌兩次，每次10ml過(guò)空氣過(guò)空氣10秒，將水?dāng)D出柱子秒，將水?dāng)D出柱子分次加甲醇分次加甲醇1.5ml，自然洗脫，過(guò)空氣，定容至，自然

15、洗脫，過(guò)空氣，定容至2ml免疫親和柱的原理免疫親和柱的原理利用利用抗原抗體免疫反抗原抗體免疫反應(yīng)應(yīng)的原理，使用大劑量的原理，使用大劑量的單克隆抗體，選擇性的單克隆抗體，選擇性的將樣品提取液中的黃的將樣品提取液中的黃曲霉毒素吸附，用水將曲霉毒素吸附，用水將雜質(zhì)洗脫除去，再用甲雜質(zhì)洗脫除去，再用甲醇定量將黃曲霉毒素洗醇定量將黃曲霉毒素洗脫，達(dá)到分離凈化目的脫，達(dá)到分離凈化目的黃曲霉毒素黃曲霉毒素單克隆抗體單克隆抗體雜質(zhì)雜質(zhì)黃曲霉毒素的衍生化黃曲霉毒素的衍生化衍生原因衍生原因 黃曲霉毒素黃曲霉毒素B1、G1熒光遇水要淬滅熒光遇水要淬滅，檢測(cè)前需要，檢測(cè)前需要衍生化衍生化藥典附錄收載的兩種衍生方法藥典

16、附錄收載的兩種衍生方法 碘衍生法：碘作為衍生劑，對(duì)衍生溫度有要碘衍生法：碘作為衍生劑，對(duì)衍生溫度有要求，試劑對(duì)儀器有腐蝕性，需要沖洗求，試劑對(duì)儀器有腐蝕性，需要沖洗 光化學(xué)衍生法：紫外光燈（光化學(xué)衍生法：紫外光燈（254nm ）照射，）照射，操作簡(jiǎn)單，對(duì)衍生溫度無(wú)要求，不需要其他操作簡(jiǎn)單，對(duì)衍生溫度無(wú)要求，不需要其他衍生劑，無(wú)需沖洗衍生劑，無(wú)需沖洗 對(duì)黃曲霉毒素對(duì)黃曲霉毒素B1和和G1進(jìn)行衍生進(jìn)行衍生，黃曲霉毒素，黃曲霉毒素B2和和G2不受該衍生步驟的影響不受該衍生步驟的影響AFB1AFG1黃曲霉毒素的衍生化黃曲霉毒素的衍生化黃曲霉毒素的衍生化黃曲霉毒素的衍生化結(jié)果報(bào)告結(jié)果報(bào)告低于檢測(cè)限低于檢

17、測(cè)限（標(biāo)出檢測(cè)限）（標(biāo)出檢測(cè)限）報(bào)告具體值報(bào)告具體值未檢出未檢出限度內(nèi)限度內(nèi)限度外限度外報(bào)告具體值報(bào)告具體值方法難點(diǎn)方法難點(diǎn)痕量分析痕量分析ppb級(jí)，要求高靈敏度級(jí)，要求高靈敏度毒性強(qiáng)，具有一定的風(fēng)險(xiǎn)性毒性強(qiáng)，具有一定的風(fēng)險(xiǎn)性安全防護(hù)措施安全防護(hù)措施基質(zhì)復(fù)雜基質(zhì)復(fù)雜注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)取樣的代表性取樣的代表性 黃曲霉毒素在樣品中分布不均勻黃曲霉毒素在樣品中分布不均勻免疫親和柱的使用免疫親和柱的使用 儲(chǔ)存、使用溫度（使用說(shuō)明書）儲(chǔ)存、使用溫度（使用說(shuō)明書）安全防護(hù)安全防護(hù) 操作人員專門培訓(xùn)，全程穿工作服佩戴手套操作人員專門培訓(xùn)，全程穿工作服佩戴手套注意事項(xiàng)及實(shí)驗(yàn)室建議注意事項(xiàng)及實(shí)驗(yàn)室建議對(duì)照品的使用對(duì)照品的使用 使用黃曲霉毒素混合對(duì)照品使用黃曲霉毒素混合對(duì)照品，不使用黃曲霉毒，不使用黃曲霉毒素固體純品自行配置素固體純品自行配置 對(duì)照品貯備液避光、低溫、密閉